種蛋感染蠟狀芽孢桿菌的分離鑒定及其藥敏試驗

李 紅，易建中，劉成倩，嚴華祥*（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上?！?06；上海佳牧生物制品有限公司，上海　006）

種蛋感染蠟狀芽孢桿菌的分離鑒定及其藥敏試驗

李 紅1，2，易建中1，劉成倩1，嚴華祥1*
（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）

通過生化試驗、序列分析和藥敏試驗等方法，研究了19日齡雞胚中細菌的存在情況及其耐藥性。結(jié)果表明：經(jīng)NCBI Blast比對確定分離的5個菌株均為蠟狀芽孢桿菌，與GenBank上登錄的蠟狀芽孢桿菌KF150385、JX566534、KF475814菌株高度同源，同源性高達99.4%；5株分離菌株間也高度同源（99.9%）。藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5株蠟狀芽孢桿菌對環(huán)丙沙星、麥迪霉素、丁胺卡那、紅霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星敏感，對多黏霉素B、復(fù)方新諾明、青霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定具有耐藥性。

雞胚；蠟狀芽孢桿菌；分離鑒定；16S rRNA；藥敏試驗

影響種蛋孵化率除了遺傳因素還有種蛋因素，如蛋的破損與畸形、蛋殼的清潔消毒等，其中細菌性因素是影響孵化率的重要因素之一。傳統(tǒng)的細菌鑒定方法是對細菌進行純培養(yǎng)，然后從形態(tài)特征、生化特性及免疫學(xué)特性等方面進行鑒定。細菌作為單細胞生物，具有多態(tài)性，易變異，導(dǎo)致某些生化反應(yīng)不穩(wěn)定，且受臨床抗生素使用的影響，有些菌株僅依靠形態(tài)和生化反應(yīng)難以準確鑒定［1］。在利用傳統(tǒng)方法鑒定細菌時經(jīng)常遇到一些不能鑒定到種的菌株，而這些菌株對臨床診斷或流行病學(xué)研究具有重要意義。因此，需要借助其他方法對其進行準確鑒定。16S rRNA基因是細菌染色體上與編碼 rRNA相對應(yīng)的dNA序列，長約1.5 kb，存在于所有原核微生物中，但不存在于真核生物及病毒中，在進化過程中高度保守，被稱為細菌的“分子化石”，可用于研究不同生物物種間的親緣關(guān)系。同時其保守性又是相對的，在保守區(qū)存在著9—10個變異區(qū)（V1—10），不同的科、屬、種間均有不同程度的差異，故又可作為細菌分類鑒定的靶分子［2］。

目前，臨床上通常采用形態(tài)觀察和生化試驗鑒定病原細菌，較少采用遺傳學(xué)分析法。本研究運用16S rRNA基因序列分析鑒定19日齡雞胚中細菌的存在情況及其耐藥性，以期為雞場的檢疫及凈化工作提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

雞胚采集于上海家禽育種有限公司種雞場；大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑

PCR純化試劑盒、克隆載體pEASY-T1均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ex TaqdNA聚合酶購自TaKaRa生物工程公司；藥敏片購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3樣品的處理

在超凈工作臺上，將采集的19日齡雞胚20枚放于紫外燈下殺菌30 min，然后用無菌酒精棉球擦拭整個蛋殼，用無菌的鑷子打開雞蛋外殼，用滅菌的棉拭子蘸取雞胚內(nèi)容物，將棉拭子放入緩沖蛋白胨水內(nèi)進行增菌培養(yǎng)。有5個雞胚長菌，取菌液于LB平板上劃線培養(yǎng)，獲取單菌落。

1.416SrRNA PCR擴增與測序

PCR反應(yīng)的通用引物序列參照文獻［3］，目的片段長為1500bp。引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR擴增體系為50μL，引物濃度為0.2μmol/μL，Taq聚合酶濃度為0.025 U/μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40s，50℃退火40s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。利用PCR回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連入pEASY-T1克隆載體，利用F13通用引物（M13 Forward Primer：ACTGGCCGTCGTTTTAC；M13 Reverse Primer：GTCATAGCTGTTTCCTG）篩選陽性菌落，進行測序。

1.5序列分析

將測序結(jié)果導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的Blastn在線軟件，選擇Nucleotide Collection（nr/nt）數(shù)據(jù)庫，運行Blastn程序，獲取與該16S rRNA基因序列同源的序列和對應(yīng)的細菌名稱。相似度大于99%的細菌判定為同種細菌，相似度介于95%—99%判定為同屬；相似度在91%—95%判定為同科［4］。

1.6生化試驗

取菌液分別接種到葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖培養(yǎng)基中進行糖發(fā)酵試驗；接種到MSP斜面、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸鹽和淀粉培養(yǎng)基進行生化特性測定，接種后，放入37℃溫箱，培養(yǎng)48 h，觀察試驗結(jié)果。

1.7藥敏試驗

對雞胚中檢出的菌采用紙片擴散法進行藥敏試驗，選擇常用抗菌藥物相對應(yīng)的藥敏紙片。按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準（WS/T 125—1999）對結(jié)果進行判斷。

圖1　雞胚培養(yǎng)液　PCR檢測結(jié)果Fig.1　PCRdetection result of chicken embryo culture fluid

2　結(jié)果與分析

2.1雞胚內(nèi)容物的培養(yǎng)

20個19日齡雞胚打開后，發(fā)現(xiàn)有1個雞胚已經(jīng)死亡。將雞胚內(nèi)容物放入37℃進行增菌培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)20個雞胚中有5個雞胚（A、B、C、D、E）有細菌生長繁殖，其中1個為死亡雞胚。有菌的雞胚，劃線獲取單菌落，每個平板分別挑取4個單菌落，進行 PCR鑒定。如圖 1所示，A雞胚中1、2號為陽性菌落；B雞胚中1、2號為陽性菌落；C雞胚中3號為陽性菌落；D雞胚中2、3、4為陽性菌落；E雞胚中1、2、4為陽性菌落。A、B、C、D、E雞胚中的所謂非陽性菌落似乎也有條帶，存在以下可能：可能是鄰近陽性孔樣品檢測液流入導(dǎo)致微弱條帶；可能是含菌量太低，擴增后條帶比較弱。為了避免假陽性以及減少檢測成本，PCR弱陽性的沒有進行載體構(gòu)建，以及后續(xù)的測序工作。

2.216SrRNA PCR擴增與測序

利用16SrRNA通用引物對單菌落進行PCR擴增鑒定，在1500bp左右擴增出特異性帶，利用PCR回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物連入pEASY-T1克隆載體，利用F13通用引物篩選陽性菌落（A雞胚中1、2菌液；B雞胚中1、2號菌液；C雞胚3號菌液；D雞胚中2、3、4號菌液；E雞胚中1、2、4號菌液）進行測序。將測序結(jié)果導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的Blastn在線軟件，選擇Nucleotide Collection（nr/nt）數(shù)據(jù)庫，運行Blastn程序，獲取與該16S rRNA基因序列同源的序列和對應(yīng)的細菌名稱，比對結(jié)果顯示與蠟狀芽孢桿菌同源性最高。將序列導(dǎo)入DNAstar軟件，與NCBI中同源性最高的蠟狀芽孢桿菌（JX566534、KF150385、KF475814）序列進行比對，結(jié)果如圖2所示。

圖2　雞胚菌與3株蠟狀芽孢桿菌序列比對結(jié)果Fig.2　Sequence comparison results of the bacteria in chicken embryos and 3strains of Bacillus cereus

2.3比對細菌16S rRNA基因序列同源性

將序列導(dǎo)入DNAman軟件，分析得出5個菌株的16S rRNA基因序列同源性在99.9%左右；將序列導(dǎo)入ClustalX軟件，在菜單中選擇Alignment-Do Complete Alignment，得到細菌的16S rRNA基因序列同源性比對結(jié)果。A（1，2）、B（1，2）、C（3）、D（2，3，4）、E（1，2，4）序列比對如圖3所示，其中序列不一致的位置標在括號中注出。測序結(jié)果B-1和B-2相同，因此序列同源性比對時，只選擇B-1進行比對。

圖3　雞胚內(nèi)細菌核苷酸同源性比對結(jié)果Fig.3　Nucleotide homology comparison results of the bacteria in chicken embryos

2.4分離培養(yǎng)

蠟狀芽孢桿菌在有氧或無氧的條件下均能生長，無氧比有氧生長好。1）菌落形態(tài)：在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，可形成圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落，直徑5—7 mm。2）個體形態(tài)：將分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)的培養(yǎng)基制片，作革蘭氏染色，可見單個散在或形成3—5鏈狀排列，有偏端芽孢，菌體兩端鈍圓，為革蘭氏陽性較大的短桿狀菌落（圖 4）。3）液體培養(yǎng)性狀結(jié)果：蠟狀芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基中呈均勻分化混濁生長，培養(yǎng)24 h后，形成小塊狀沉淀，沉于管底，振搖不散。

2.5生化試驗

蠟狀芽孢桿菌能分解葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖并產(chǎn)酸，不能分解乳糖。硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗、淀粉水解酶試驗、接觸酶試驗、VP均為陽性，吲哚試驗為陰性（表1）。

圖4　蠟狀芽孢桿菌鏡檢結(jié)果（×1 000倍）Fig.4　Microscopic examination result of Bacillus cereus（×1 000 times）

2.6藥敏試驗

雞胚中分離的菌為蠟狀芽孢桿菌，對環(huán)丙沙星、麥迪霉素、丁胺卡那、紅霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星敏感，但對多黏霉素B、復(fù)方新諾明、青霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定具有耐藥性。

表2　不同抗生素對蠟狀芽孢桿菌的耐藥程度Table 2　Resistance ofdifferent antibiotics to Bacillus cereus

3　結(jié)論與討論

近40年來，抗生素、激素、防腐劑等藥物性飼料添加劑在動物飼養(yǎng)中的廣泛應(yīng)用有力地促進了動物飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，藥物性添加劑的普遍應(yīng)用給人們帶來了難以克服的弊端。美國食品和藥物管理局公布了42種安全的益生菌，主要為乳酸桿菌、芽孢桿菌，酵母菌等［5］。蠟狀芽孢桿菌作為飼料添加劑已經(jīng)在多種動物飼養(yǎng)實驗中應(yīng)用。不論在畜禽養(yǎng)殖業(yè)，還是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用，都取得了樂觀的效果［6］。為搞清楚本研究中蠟狀芽孢桿菌是否為有益蠟狀芽孢桿菌，下一步可開展培養(yǎng)基適應(yīng)性、溫度適應(yīng)性、耐酸堿性、代謝產(chǎn)物測定以及動物試驗。若其為優(yōu)良的蠟狀芽孢桿菌，可以考慮作為飼料添加劑替代激素、抗生素、防腐劑。

蠟狀芽孢桿菌是廣泛分布于土壤、水、空氣、植物、飼料和各種食品的好氣、中溫、產(chǎn)芽孢的桿菌。該菌常處于孢子和休眠狀態(tài)下，極易污染食物；一般不致病，但有的菌株可引起食物中毒［7-8］。該菌具有耐高溫（100℃）、耐酸堿、耐擠壓和耐受顆粒飼料加工的影響等特點，因此在飼料中可長期存在，一旦有致病菌株污染飼料，其孢子進入腸道后，便能迅速在腸道上部復(fù)活（復(fù)活率接近100%）［9］，對畜禽的健康構(gòu)成潛在威脅。最近研究表明，該菌在自然情況下可引起牛的乳房炎、駱駝的“膿皰病”［10］、犬和豬的腹瀉等；在特定的條件下也可引起人急性發(fā)作的嘔吐綜合征及與其他食物引起的慢性腹瀉綜合征［11］。蠟狀芽孢桿菌污染的飼料和各類食品大多無腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，在組織和感官鑒定時，除米飯有時微發(fā)粘或入口不爽外，大多數(shù)食品均表現(xiàn)為完全正常的感官性狀，往往易被人們所忽視。本研究檢測到雞胚中存在蠟狀芽孢桿菌，雞胚的死亡是否是蠟狀芽孢桿菌引起，還有待于進一步確證。雞胚中蠟狀芽孢桿菌的存在是飼料中存在的，還是外界污染造成的，或是雞腸道內(nèi)存在蠟狀芽孢桿菌而導(dǎo)致雞蛋的污染，還有待于進一步的研究。細菌性因素是影響孵化率的一個重要因素，因此，要做好雞場的檢疫及凈化工作。

科學(xué)合理地用藥是減少細菌產(chǎn)生耐藥性最有效的方法。所以，應(yīng)盡量提高對疾病診斷的準確率，減少不必要的用藥，并嚴格用藥劑量和療程；加強對細菌耐藥性的監(jiān)測，為大多數(shù)養(yǎng)雞場（戶）的用藥提供科學(xué)依據(jù)。

［1］張守印，李振軍，張集，等.16S rRNA基因序列分析在非典型菌株鑒定中的應(yīng)用［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（4）：616-617.

［2］GRAY M W，SAONKOFFd，CEDERGREN R J.On the evolutionarydescent of organisms and organelles：aglobal phylogeny based on a highly conservedstructural core insmallsubunitribosomal RNA［J］.Nucleic Acids Res，1984，12（14）：5837-5852.

［3］BOSSHARD P P，ZBINDEN R，ABELSs，et al.16S rRNAgenesequencing versus the API 20 NEsystem and the VITEK 2 ID-GNB card for identification of nonfermentinggramnegative bacteria in the clinical laboratory［J］.J Clin Microbiol，2006，44（4）：1359-1366.

［4］FOXg E，MAGRUM L J，BALCH W E，et al.Classification of methanogenic bacteria by 16S ribosomal RNA characterization［J］.Proc Natl Acadsci USA，1977，74（10）：4537-4541.

［5］王麗娟.益生菌的研究及其應(yīng)用進展［J］.飼料博覽，1999，11（1）：15-18.

［6］黃麗彬，陳有榮，齊鳳蘭.蠟狀芽孢桿菌在飼料中的應(yīng)用［J］.糧食與飼料工業(yè)，2001（9）：32-33.

［7］董永勝，許軍.甜高粱秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工藝研究［J］.釀酒，2007，34（4）：49-51.

［8］楊佐毅，李理，劉冬梅，等.白腐乳中蠟狀芽孢桿菌的分離與鑒定［J］.中國釀造，2008（17）：39-47.

［9］黃麗彬，陳有榮，齊鳳，等.蠟狀芽孢桿菌在飼料中的應(yīng)用［J］.糧食與飼料工業(yè)，2001（9）：32-33.

［10］魏建功，王梅巖，蔡妙英，等.蠟狀芽孢桿菌對駱駝的致病性的研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，1990，16（4）：10-11.

［11］BBI.Internationnalstatus of largescale production and use of fuel ethanolin in Brazil［C］.Beijing World Fuel Ethanol Congress，2001.

（責任編輯：閆其濤）

Isolation，identification anddrugsensitivity test of hatching eggs infected Bacillus cereus

LI Hong1，2，YI Jian-zhong1，LIU Cheng-qian1，YAN Hua-xiang1*
（1Institute of Animal Husbandry&Veterinaryscience，Shanghai Academy of Agriculturalsciences，Shanghai 201106，China；2Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai 201106，China）

The existingsituation anddrug resistance of bacteria in 19day old chicken embryos werestudied by biochemical test，sequence analysis anddrugsensitivity test.The resultsshowed that the 5strains were identified as Bacillus cereus by NCBI Blast comparison，and had highly homologous（99.4%）with KF150385，JX566534 and KF475814strains registered ingenBank，and the 5strains were highly homologous（99.9%）also.drugsensitivity test resultsshowed that the 5 Bacillus cereusstrains weresensitive to ciprofloxacin，medemycin，amikacin，erythromycin，neomycin，kanamycin，gentamicin，norfloxacin，ofloxacin，and resistant to polymyxin B，compoundsulfamethoxazole，penicillin，ampicillin，cefalexin，cefradine.

Chicken embryo；Bacillus cereus；Isolation and identification；16S rRNA；Drugsensitivity test

S852.6

A

1000-3924（2016）04-087-05

2015-09-17

上海市科技人才計劃（14YF1414600）

李紅（1983—），女，博士，助理研究員，主要從事動物分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究。Tel：021-62204612，E-mail：lihong20061029 @163.com

嚴華祥（1966—），男，博士，研究員，研究方向：蛋雞育種與雞蛋安全。Tel：021-62205472，E-mail：yansafety@qq.com