三斑海馬水提物抗氧化活性研究

陳莉萍,申鉉日,*,陳國華,孫菲菲,金美娜

(1.海南大學食品學院,海南海口 570228;2.海南大學海洋學院,海南海口 570228)

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三斑海馬水提物抗氧化活性研究

陳莉萍1,申鉉日1,*,陳國華2,孫菲菲1,金美娜1

(1.海南大學食品學院,海南海口 570228;2.海南大學海洋學院,海南海口 570228)

本文探討三斑海馬小分子水溶性提取物的抗氧化能力。以三斑海馬干燥體粗粉為原料,經95%乙醇回流提取,系統溶劑提取獲得不同極性提取物,并對水提物進一步分離及抗氧化活性評價。經Sephadex G-10凝膠過濾層析分離得到6個組分。對組分清除DPPH自由基,超氧陰離子自由基和羥基自由基能力,總還原力等抗氧化能力以及總氨基酸和總酚含量進行測定和評價。實驗結果表明,在分離獲得的6個組分中FrⅣ的DPPH自由基清除活性最高,其IC50=0.25 mg/mL。FrⅣ的總還原力較高,羥基自由基清除活性及鐵離子螯合能力最強。表明三斑海馬小分子水溶性提取物的抗氧化活性與總酚、總氨基酸、小分子肽的含量和類型密切相關。

三斑海馬,水提物,抗氧化活性

三斑海馬(HippocampustirmaculatusLeach)為脊索門魚綱刺魚目海龍科海馬屬的珍稀海洋硬骨魚[1]。其體內含有多種生物活性物質,主要包括甾體類化合物、磷脂、氨基酸等[2],其功效為抗疲勞[3]、抗關節炎[4]、抗菌[5]。現代生命科學研究表明,活性氧簇/氮簇在人體中產生能引起氧化損傷和一些退行性疾病,如老化、癌癥[6],抗氧化劑被認為是自由基清除劑。近年來,從天然產物獲取天然抗氧化劑引起人們極大興趣,在醫藥、人類營養和食品工業已受到廣泛關注。目前,不同植物、動物來源水溶性組分中分離得到不同抗氧化活性成分。已有的海馬研究工作主要集中在脂溶性成分的分析研究上[7],而對水溶性小分子的研究較少。

本研究以三斑海馬為研究對象,探討了其小分子水提物的分子量分布,評價其抗氧化活性,初步探討了其分離物的組成成分與抗氧化活性之間的關系,以期提升三斑海馬的藥用價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

三斑海馬購自海南龍盛生物科技發展有限公司,干燥體。

DPPH自由基即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼購自Sigma化學試劑公司;福林酚試劑國藥集團,生化試劑。其他使用的化學品和試劑均為市售的分析純。

7200可見光分光光度計尤尼柯上海有限公司;TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;TDL-60B離心機上海圣科儀器設備有限公司;EL204電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司;M37610-33CN渦旋混合器賽默飛科技中國制造;DK-600電熱恒溫水溫箱上海精宏實驗設備有限公司;RE-5299旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;BT102S恒流泵保定雷弗流體科技有限公司;HD-5電腦紫外檢測儀南京大學普陽科學儀器研究所;層析柱上海煊盛生化儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1水提物制備與水提物分離三斑海馬干品購自廣州中藥材市場,將樣品用自來水沖洗并除去內臟等,60 ℃烘干至恒重,粉碎過20目篩,分析純級95%乙醇以1∶10(m/v)比例,回流提取,每次提取2 h,重復三次,獲得海馬乙醇粗提取物。粗提液經真空泵布氏漏斗后抽濾,獲得濾液,60 ℃下真空旋轉蒸發濃縮至浸膏狀。原料與去離子水1∶1(m/v)混懸。用系統溶劑萃取法,依次與相同體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取,各重復操作三次。獲得四種組分(石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、水),即極性從小到大的提取物。水提取物經旋轉蒸發儀減壓濃縮,冷凍干燥,計算水提取物的得率。水提取物用于進一步分離。使用前貯存于-20 ℃冰箱中。

水提取物通過葡聚糖凝膠G-10色譜柱進行分離,分析條件為,層析柱:1.2 cm×80 cm;填料:葡聚糖凝膠G-10(北京瑞達恒輝科技發展有限公司);檢測波長:230 nm;進樣量:50 mg/mL;進樣體積:2.0 mL;洗脫溶劑:去離子水;流速:1.0 mL/min。

1.2.2總酚和總氨基酸含量的測定

1.2.2.1總酚含量的測定總酚含量測定采用修改的福林-喬卡梯奧(Folin-Ciocalteu)[8]方法,含量表示為mg EGCG/g組分。

1.2.2.2總氨基酸含量測定參照寧正祥[9]方法進行組分總氨基酸含量的測定,含量表示為mg甘氨酸/g組分。

1.2.3抗氧化活性測定

1.2.3.1DPPH·清除率測定參照Om P. Sharma等[10]的方法,配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液。分別設置空白組、樣品組、控制組。暗處反應20 min,分光光度計測定517 nm處的吸光值。VC作為陽性對照組。

DPPH·清除率根據以下公式計算:

式(1)

式(1)中,清除自由基能力表示為IC50(mg/mL),即抑制率為50%時的樣品濃度。DPPH·清除能力較好的組分將進一步分析其他抗氧化活性。

1.2.3.2總還原力的測定參照江慎華[11]的方法。測定標準品維生素C陽性對照組的總還原力。

1.2.3.3羥自由基清除率的測定參照李莉等[12]的方法。10 mL試管中依次加入1.5 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1.0 mL、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)2.0 mL和去離子水1.0 mL,充分混勻,加入1.5 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL,邊渦旋混合邊加入,再加入0.015% H2O2溶液1.0 mL,置于37 ℃水浴中反應1 h,以體積比為2∶1的緩沖液和去離子水作為參比液,在510 nm處測定吸光度A1。用1.0 mL去離子水代替1.0 mL 0.015% H2O2,在510 nm測其吸光度A2;用不同濃度的樣品代替1.0 mL雙蒸水,在510 nm處測定吸光度A3,每次加樣品充分搖勻。按式(2)計算抑制率:

式(2)

1.2.3.4鐵離子螯合能力的測定參照Decker[13]的方法稍作修改。在1 mL不同濃度的小分子水提物組分溶液中依次加入3.7 mL去離子水、0.1 mL 2 mmol/L FeSO4·7H2O和0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪,混勻后置室溫下20 min,562 nm處測定其OD值。每個樣品平行測定3次,取其平均值。以去離子水作為空白對照,EDTA二鈉鹽作為陽性對照品。

根據式(3)計算提取物的Fe3+鰲合能力:

式(3)

式(3)中,A0為空白對照的OD值,A1為加有樣品或者陽性對照后的OD值。

1.2.4統計學分析數據以平均數±標準偏差(x±S.D.)表示,OriginPro 7.5計算IC50,SPSS 17.0統計軟件進行單因素差異分析。通過ANOVA進行數據間的差異分析,p<0.05,差異顯著,p<0.01,差異極顯著。

2　結果與分析

2.1三斑海馬水提取物的分離

2.1.1三斑海馬水提物Sephadex G-10凝膠層析葡聚糖凝膠排阻層析是依據分離物分子量大小進行分離的技術,洗脫物的分子量越大最先被洗脫出來,分子小的后被洗脫出來。由圖1可知,三斑海馬水提物通過Sephadex G-10凝膠分離得到6個峰,分別為FrⅠ、FrⅡ、FrⅢ、FrⅣ、FrⅤ、FrⅥ。

圖1　Sephadex G-10凝膠過濾層析分離洗脫曲線Fig.1　Elution profile of Gel filtration chromatography of Sephadex G-10

2.1.2三斑海馬水提物Sephadex G-10凝膠層析酚類及氨基酸的分布收集Sephadex G-10凝膠過濾層析餾分3 mL/管,每管取1 mL進行總酚含量和總氨基酸含量測定。以管數為橫坐標X,總酚含量為縱坐標Y1,總氨基酸含量為縱坐標Y2,繪制雙縱坐標曲線。福林酚法已被廣泛用于測定混合體系中總酚含量,然而該方法有一些不足之處,福臨酚試劑在堿性條件下也與一些非酚類還原化合物比如氨基酸等反應。

圖2　Sephadex G-10凝膠層析總酚及總氨基酸分布Fig.2　Distribution of total phenolics and total amino acid of Sephadex G-10 gel chromatography

2.2各組分成分測定

表1　各組分的總酚含量及總氨基酸含量Table 1　Total phenolics content and the total amino acid content of each fraction

FrⅠ～FrⅣ均含有酚類化合物,其含量有差異,其中FrⅥ總酚含量最高為(298.38±5.78) mg EGCG/g組分,而其分子量也是最小。組分中FrⅠ、FrⅡ、FrⅣ檢測到氨基酸或小分子肽,其中FrⅡ的含量最高為(128.938±0.252) mg Gly/g組分。

2.3抗氧化活性

2.3.1DPPH·清除力DPPH自由基由于苯環的共軛和位阻及硝基的電子作用,是一種穩定的自由基,其在乙醇溶液呈紫色,當DPPH溶液中加入自由基清除劑時,DPPH自由基的單電子被配對而使其紫色變淺,A517nm值變小,而吸光值變小的程度與自由基被清除的程度呈劑量依賴的線性關系[14],因此用來檢測自由基清除情況,本實驗將DPPH自由基清除能力作為評價抗氧化能力較強的三斑海馬水提物凝膠層析分離組分的初步篩選指標。FrⅣ、FrⅤ和FrⅥ用于進一步的抗氧化活性評價。

表2　各組分DPPH·清除力IC50Table 2　IC50 of DPPH radicals scavenging ability of each fraction

圖3　組分的DPPH·清除Fig.3　Free radical scavenging rate of FrⅣ～FrⅥ

DPPH自由基被廣泛應用于評價天然產物清除自由基活性的實驗中。對于分離組分的DPPH·清除能力實驗結果表明,FrⅣ(IC50=0.25 mg/mL)>FrⅥ(IC50=0.58 mg/mL)>FrⅤ(IC50=2.01 mg/mL)。各組分的DPPH·清除能力明顯弱于對照組VC,FrⅣ雖與VC的DPPH自由基清除能力相差一個數量級,但與FrⅥ相比具有較高的DPPH·清除能力,其可能與FrⅣ含有小分子肽、游離氨基酸和酚類化合物有關,這些物質可作為供氫體。

2.3.2總還原力還原能力是評價抗氧化能力的一個重要指標,也是抗氧化機理之一。抗氧化劑通過自身的抗氧作用給出電子而清除自由基,還原力越強,抗氧化性越強。在檢測濃度范圍內,相同濃度下組分的總還原力大小依次為FrⅣ>FrⅥ>FrⅤ。其中FrⅣ濃度為1.0 mg/mL時,接近于濃度為0.2 mg/mL的VC總還原力。對于FrⅥ、FrⅤ,總還原力是與總酚含量相關。對于FrⅣ,其較高的還原力可能與組分中含有的氨基酸、小分子肽相關。

圖4　組分的總還原力Fig.4　Total reducing power of FrⅣ～FrⅥ

2.3.3羥基自由基清除力羥基自由基是已知活性最強的活性氧自由基,對照組VC的羥基自由基清除力IC50值為0.41 mg/mL,樣品組:FrⅣ(IC50=1.32 mg/mL)>FrⅥ(IC50=1.91 mg/mL)>FrⅤ(IC50=1.95 mg/mL)。分離組分中FrⅣ的具有相對較強的羥基自由基清除能力,當濃度為2.0 mg/mL,清除率達到80%,可能與組分中含有清除活性氧自由基能力較強的游離氨基酸、小分子肽有關。在測定的樣品濃度范圍內,FrⅥ、FrⅤ的羥基自由基清除能力相平。

圖5　組分的羥基自由基清除Fig.5　The hydroxyl free radical scavenging of FrⅣ-FrⅥ

2.3.4鐵離子螯合能力實驗結果表明,隨著樣品濃度的增大,各樣品的鐵離子螯合能力也隨之增加。對照組EDTA-2Na的鐵離子螯合能力的IC50值為0.074 mg/mL。樣品組的鐵離子螯合能力:FrⅣ>FrⅥ>FrⅤ,EDTA-2Na鐵離子螯合能力IC50<0.10,均顯著(p<0.01)高于各個樣品組的鐵離子螯合能力。

圖6　組分的鐵離子螯合能力Fig.6　Ferrous ion chelating ability of FrⅣ～FrⅥ

魚類中存在抗氧化化合物保護它們的脂質和其他含有雙鍵的化合物,用于減少活性氧簇對其引起的損傷,這些化合物含有很多化學基團,通過不同機制發揮抗氧化作用。這些包括氨基酸、肽、抗壞血酸、類胡蘿卜素、酚類化合物等[15-17]。三斑海馬作為一種不可直接食用的海洋硬骨魚,水溶性組分富含多酚、氨基酸、小分子肽。本文三斑海馬水提取物經葡聚糖凝膠層析柱分離得到的不同組分,評價其基于DPPH·清除、·OH清除、總還原力、Fe3+螯合能力的抗氧化活性。結果表明分離組分中的FrⅣ-Ⅵ具有良好的自由基清除能力,在一定濃度范圍內,抗氧化活性和濃度呈劑量依賴關系。

酚類化合物是三斑海馬中抗氧化活性較強的成分,其抗氧化活性據研究表明是由于氧化還原性質[18],能夠吸收和中和自由基,淬滅單線態氧和三重態氧,或分解過氧化物。楊梅葉水提物的DPPH自由基清除IC50為73.7 μg/mL,其抗氧化活性和高濃度的酚類化合物有關[19]。Rossita Shapawi1等[20]評價了鮑氏海馬的不同極性提取物的抗氧化性,表明與總酚含量相關,其酚類化合物的分布和極性相關,其中極性較大的水溶性組分的抗氧化活性也較強。

氨基酸常被認為是具有協同作用的抗氧化劑。它們協同機制可能有以下兩個方面解釋:通過與促進氧化的微量金屬螯合或使已被氧化的抗氧化劑得以再生。已經表明了氨基酸作為天然食品中具有協同抗氧化的作用[21]。已經研究表明,氨基酸能和其他抗氧化劑產生共價鍵,形成比抗氧化劑本身的抗氧化活性更高的合成衍生物。同時,氨基酸本身可以作為抗氧劑,張英等[21]研究19種氨基酸對活性氧自由基的清除能力,表明氨基酸普遍具有生物抗氧化活性。大豆水解物中蛋白肽種類和含量與抗氧化活性存在關系,分子量減小將有助于提高抗氧化活性,游離氨基酸和小分子肽的抗氧化活性比分子量較大的蛋白活性明顯提高[23]。分離組分中FrⅣ具有較強的抗氧化活性可能與其組分中含有氨基酸、小分子肽、酚類化合物有關,該組分中的氨基酸可能協同酚類物質產生強有力的抗氧化活性。

三斑海馬小分子水提物不同組分的抗氧化活性和氨基酸、小分子肽、酚類化合物有關,且和含量、類型有關。FrⅣ相對FrⅠ、FrⅡ的總氨基酸差異不顯著(p>0.05),但是含有較高含量的總酚,其DPPH·清除能力較強,表明和總酚含量相關。FrⅤ、FrⅥ中不含有氨基酸,FrⅤ、FrⅥ的差異在總酚含量和酚類化合物分子量,FrⅥ具有較高含量的總酚,其抗氧化活性強于FrⅤ的。FrⅣ具有較好的DPPH·清除力、·OH清除力、總還原力、鐵離子螯合率,表明其組分中的總酚、氨基酸、小分子肽具有良好的抗氧化活性,或者其表現出的抗氧化活性是氨基酸與其他抗氧化劑協同作用的結果。

3　結論

本文對三斑海馬水提物的抗氧化活性進行探討,初步證實了三斑海馬小分子水提物具有抗氧化活性,抗氧化活性與組分的酚類、氨基酸含量與種類關系密切。具體氨基酸以及酚類物質的組成有待進一步分析,氨基酸是否協同其他抗氧化劑促進抗氧化活性有待進一步論證。

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Antioxidant activity of aqueous extract from Three-spot hippocampus

CHEN Li-ping1,SHEN Xuan-ri1,*,CHEN Guo-hua2,SUN Fei-fei1,JIN Mei-na1

(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China;2.College of Ocean,Hainan University,Haikou 570228,China)

The antioxidant capacity of aqueous soluble extract with small molecules of Three-spot hippocampus was investigated. Three-spot seahorse was taken as raw material,extracts were obtained via reflux extraction using 95% ethanol and systematic solvent extraction. Aqueous extract was selected for further analysis amongst the resulted various polar extracts. Six fractions were obtained by eluting through Sephadex G-10 gel filtration chromatography. Anti-oxidative activities of DPPH free radical scavenging,and hydroxyl radical scavenging,total reducing power and ferrous ion chelating ability were determined and evaluated at multiple concentrations and total polyphenols and total amino acids of varying fractions. The results indicated:by contrast,DPPH free radical clearance of FrⅣ was the highest with the of IC50of 0.25 mg/mL. Total reducing power FrⅣ was potent,FrⅣ exhibited the highest capacity for scavenging hydroxyl radical and ferrous ion chelating ability. Collectively,the antioxidant activity of aqueous soluble extract with small molecules of Three-spot hippocampus seemed to have correlation with the distinct contents and types of phenolic compounds,amino acids,small molecular peptides.

Three-spot hippocampus;aqueous extract;antioxidant activity

2015-06-23

陳莉萍(1987-),女,碩士研究生,研究方向:水產品精深加工,E-mail:705285070@qq.com。

申鉉日(1968-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物資源利用、食品科學,E-mail:shenxuanri2009@163.com。

十二五國家科技支撐計劃課題(2013BAB01B04)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)03-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.015