產天冬氨酸酶菌株大腸桿菌HY05C發酵培養基及培養條件的優化

喬　君,田延軍,*,馬玉岳,姜國政,趙祥穎,劉建軍

(1.山東省食品發酵工程重點實驗室,山東濟南 250013;2.煙臺恒源生物工程有限公司,山東煙臺 265709)

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喬君1,田延軍1,*,馬玉岳2,姜國政2,趙祥穎1,劉建軍1

(1.山東省食品發酵工程重點實驗室,山東濟南 250013;2.煙臺恒源生物工程有限公司,山東煙臺 265709)

為提高大腸桿菌HY-05C在L-天冬氨酸生產過程中的菌體濃度,進而提高單位體積培養液中L-天冬氨酸酶酶活,本文對該菌株的培養基和培養條件進行了優化。首先通過正交實驗對大腸桿菌HY-05C培養基組成進行優化,確定了最佳培養基配方(g/L):富馬酸銨10,玉米漿干粉8,酵母粉2,蛋白胨7,氯化鈉5,磷酸二氫鉀1,硫酸鎂0.2。又進一步考察了對菌體濃度和酶活影響較大的因素初始pH和接種量,得到了最適pH=6.0,最佳接種量為1.0‰,在上述最佳培養基及培養條件下對大腸桿菌HY-05C的酶轉化進程進行測定,優化后培養液的轉化效率較初始提高150%,同時也驗證了通過發酵條件優化提高單位體積的菌體濃度,提高L-天冬氨酸轉化效率方法的可行性。

L-天冬氨酸,大腸桿菌,培養基,培養條件,酶活,優化

L-天冬氨酸(L-Aspartic acid),又名α-氨基丁二酸,分子式C4H7O4N,等電點pI=2.77,略酸,微溶于水,不溶于乙醇或乙醚[1]。L-天冬氨酸是一種常見的酸性氨基酸,在醫藥、食品、美容、化工、材料等方面具有非常廣泛的用途[2-3]。以L-天冬氨酸為原料合成的阿斯巴甜和紐甜,適用于兒童、孕婦、哺乳期婦女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者內的所有人群[4-5]。L-天冬氨酸還參與鳥氨酸循環,可用做氨解毒劑、肝機能促進劑、疲勞恢復劑等藥品和食品添加劑[6]。L-天冬氨酸的工業化生產始于1974年的日本[7],我國在20世紀80年代后期也進行了工業化生產[8]。L-天冬氨酸的制備主要是利用L-天冬氨酸酶催化氨與富馬酸發生加成反應得到,有固定化酶法和游離整體細胞法兩種方式,游離整體細胞法與固定化細胞法相比,具有酶活力高,工藝簡潔,設備投資少等優勢[9],是當今生產L-天冬氨酸的主流工藝。

目前,提高L-天冬氨酸合成效率的方法主要集中在:篩選高產天冬氨酸酶菌株[10-12]、優化天冬氨酸酶轉化條件[13-14]和改造天冬氨酸酶[15]等幾個方面。歸根結底,這些措施都是針對提高L-天冬氨酸酶產生菌的產酶量和提高天冬氨酸酶酶活兩個方面展開研究的,而這些優化方法無不具有工作量大、效果不顯著、穩定性差等缺點[16]。既然提高L-天冬氨酸酶產生菌的產酶量可以提高天冬氨酸的合成效率,那么若通過發酵條件優化提高單位體積的菌體濃度,則單位體積內的L-天冬氨酸酶總酶活也會隨之提高,也就相當于提高了L-天冬氨酸酶產生菌的產酶量。為此,本研究對L-天冬氨酸轉化菌的培養基及培養條件進行優化,獲得最佳培養基和多級培養方法,并對優化后結果進行生產驗證,以期提高單位體積培養液中的L-天冬氨酸酶酶活,提高了后續生產效率和設備利用率。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌HY-05C(EscherichiacoliHY-05C)煙臺恒源生物股份有限公司提供。

高錳酸鉀杭州振輝化工有限公司;濃硫酸南京盛慶和化工有限公司;玉米漿干粉山東康源生物科技有限公司;富馬酸煙臺恒源生物有限公司;氨水武漢制氨廠;酵母粉上海酵母廠;蛋白胨北京雙旋微生物培養基制品廠;斜面培養基玉米漿干粉3 g/L;酵母粉3 g/L;蛋白胨1 g/L;氯化鈉5 g/L;硫酸錳0.05 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0～7.2;發酵培養基富馬酸銨10 g/L;玉米漿干粉6 g/L;蛋白胨7 g/L;氯化鈉5 g/L;磷酸二氫鉀1 g/L;硫酸鎂0.2 g/L,將上述原料加適量水溶解,然后用氨水調節pH至7.0～7.2。

XNP-9052BS-Ⅲ生化培養箱上海馨朗電子科技有限公司;XL-YC恒溫搖床上海馨朗電子科技有限公司;722型分光光度計上海天普分析儀器有限公司;PY-P10型pH計德國賽多利斯集團;BSA124S-CW電子分析天平德國賽多利斯集團。

1.2轉化培養液的制備

取一環活化后斜面菌體接入500 mL(裝液量50 mL)搖瓶中,200 r/min,35～37 ℃,培養8 h,得到一級培養液;將一級種子液按1%(v/v)接種量轉接到發酵培養基中,200 r/min,培養7 h,得到二級培養液。

1.3實驗方法

1.3.1L-天冬氨酸酶酶活測定底物溶液配制:稱取富馬酸100 g,硫酸鎂0.1 g,加入適量蒸餾水攪拌均勻,緩慢加入濃氨水,調節pH7.5后定容至500 mL,既得20%的富馬酸銨溶液。

將大腸桿菌培養液加入到20%富馬酸銨底物溶液(內含1 mmol/L Mg2+)中,利用高錳酸鉀滴定法[13]測定反應體系中富馬酸量,計算酶活。

酶活定義:在45 ℃,pH7.5條件下,每小時轉化1 μmol富馬酸底物的酶量為一個酶活力單位U。

1.3.2細胞濃度測定發酵液稀釋10倍,640 nm處測定吸光度值。

1.3.3游離細胞轉化進程測定大腸桿菌HY-05C培養液與底物溶液按體積比1∶7混合搖勻,迅速放入45 ℃水浴鍋中保溫,每小時取樣,用高錳酸鉀滴定法[13]測定反映體系中富馬酸量。

1.3.4統計學分析方法本文正交實驗采用正交設計助手V3.1軟件通過直觀分析對大腸桿菌HY-05C培養基組分進行優化。其他數據采用Origin8.1軟件處理得到。

1.4實驗方法

1.4.1培養基組分優化方法在原有培養基配方的基礎上,對菌株HY-05C培養基進行優化,獲得轉化培養基。通過前期單因素實驗的結果,選取富馬酸銨、玉米漿干粉、酵母粉和蛋白胨四個對菌體生長和產酶影響較大的因素進行正交實驗優化,設計L9(34)正交實驗,以細胞濃度作為評價標準,通過直觀分析對培養基組分進行優化,正交實驗水平表如表1所示。

表1　大腸桿菌HY-05C碳氮源正交實驗水平表Table 1　Orthogonal factors level table of carbon and nitrogen sources by E.Coli HY-05C

1.4.2培養基最適pH優化方法按正交優化后配方(富馬酸銨10 g/L,玉米漿干粉8 g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨7 g/L,氯化鈉5 g/L,磷酸二氫鉀1 g/L,硫酸鎂0.2 g/L)配制培養基,用氨水調節培養基的初始pH分別為5.0、6.0、7.0和8.0,118 ℃滅菌20 min,冷卻后,取一環活化后斜面接入500 mL(裝液量50 mL)搖瓶中,200 r/min,35～37 ℃,培養8 h,測定酶活及菌體量。

1.4.3一級培養液生長曲線的測定按正交優化后配方配制培養基,氨水調節初始pH6.0,118 ℃滅菌20 min,冷卻后,接入一環活化后斜面菌種至接入500 mL(裝液量50 mL)搖瓶中,200 r/min,35～37 ℃培養,0～10 h,每2 h取樣測定酶活及菌體量。

1.4.4二級培養液接種量測定如1.4.3一級培養液培養8 h后,分別按0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰(v/v)接種量接入二級培養液,200 r/min,35～37 ℃培養,0～10 h,每2 h取樣測定菌體量。

1.4.5二級培養液生長曲線的測定其他條件保持不變(如1.4.4),改變二級培養液的接種量為1.0‰,0～12 h,每2 h取樣測定酶活和菌體量。

1.4.6原始和優化后酶轉化進程對照將分別以原始和優化后培養基培養的一級培養液15 L,接種到裝有15 m3高密度培養培養基的20 m3培養罐中,調整罐壓0.08 MPa,通風比0.25,通過調節攪拌轉速維持培養過程中相對溶解氧30%,37 ℃培養,每小時取樣測定轉化液中富馬酸濃度。

2　結果與討論

2.1大腸桿菌HY-05C培養基組分優化

利用正交設計助手V3.1軟件設計了4因素3水平的正交實驗,共有9個實驗點。正交實驗直觀分析表如表2所示。

表2　大腸桿菌HY-05C碳氮源正交實驗直觀分析表Table 2　Visual analysis table of carbon and nitrogen sources by E.Coli HY-05C

從表2可以看出,影響大腸桿菌HY-05C生長的原料主次順序為:玉米漿干粉>蛋白胨>酵母粉>富馬酸銨。最佳配方和添加量為(g/L):富馬酸銨10,玉米漿干粉8,酵母粉2,蛋白胨7。優化后的培養基酶活及菌體量變化如表3所示。

表3　優化培養基與原始培養基菌體量和酶活對照Table 3　The comparison of biomass and enzyme activity between optimized and original culture medium

從表3可以看出,培養基經優化后菌體量和酶活均相應提高,菌體量提高了約44.83%,酶活提高約51%,優化后菌體量和酶活增長比較明顯。確定了通過發酵條件優化提高單位體積的菌體濃度,提高L-天冬氨酸轉化效率方法的可行性。

2.2培養基pH對大腸桿菌HY-05C生長及酶活的影響

在培養過程中除原料外,培養基pH同樣不容忽視,pH不僅能影響菌體細胞的生長,還與天冬氨酸酶酶活力密切相關。實驗結果如圖1所示。

圖1　培養基pH對大腸桿菌HY-05C生長及酶活的影響Fig.1　Effect of pH on the growth and enzyme activity by E.coli HY-05C

從圖1中可以看出,當培養基的初始pH6.0時,培養液的酶活和菌體量最高,此時菌體量和酶活較初始培養液分別提高了51.67%和66.09%。因此,選定培養基的初始pH為6.0。

2.3大腸桿菌HY-05C一級培養液生長曲線的測定

測定大腸桿菌HY-05C一級培養液的生長及酶活進程,以確定二級培養液的最佳轉種時間。實驗結果如圖2所示。

圖2　大腸桿菌HY-05C一級培養液生長及酶活曲線Fig.2　The growth and enzyme activity of the first order growth solution

從圖2可以看出,菌體生長延滯期較短,2 h即進入對數生長期;8 h幾乎達到最高點,菌體處于對數中后期,酶活與菌體量同步增加。經轉接實驗確定一級種子培養8～10 h轉種時間最佳。

2.4大腸桿菌HY-05C二級培養液最佳接種量測定

菌株HY-05C的二級培養采用液體接種,接種量過大,不僅造成資源浪費、增加勞動強度,還會造成菌體生長緩慢等;接種量過小,生長延滯期變長,種子生長緩慢,降低生產效率,增加設備能耗。因此,確定適當的接種量尤為重要。實驗結果如圖3所示。

圖3　大腸桿菌HY-05C二級培養液最佳接種量Fig.3　Inoculation amounts of second order growth solution

從圖3可以看出,在整個培養階段,接種量1‰時,大腸桿菌HY-05C的菌體濃度最高;0～8 h,接種量1.5‰的菌體濃度和1‰基本相同;隨著接種量的增加,菌體濃度逐漸降低。因此,菌株HY-05C采用液體接種時,最佳接種量為1‰。

2.5大腸桿菌HY-05C二級培養液生長曲線的測定

測定大腸桿菌HY-05C二級培養液的生長及酶活進程,以確定二級培養液用作轉化的最佳培養時間,測定結果如圖4所示。

圖4　大腸桿菌HY-05C二級培養液的生長曲線Fig.4　The growth and enzyme activity of the second order growth solution

從圖4可以看出,由于接種量較低,二級培養液延滯期比一級種子略長,但進入對數期后菌體量增加較快,培養10～12 h基本達到穩定期。菌體培養12 h時,菌體量和酶活較初始培養基分別提高58.33%和105.61%。從數據中可以看出,L-天冬氨酸酶的酶活提高幅度遠遠大于菌體量的提高幅度,通過分析,這可能是由以下幾個方面造成的:隨著二級培養液內菌體的生長繁殖,原一級培養液內的菌體細胞衰老自溶,L-天冬氨酸酶釋放到培養液中,從而導致OD值提高不大,酶活變化幅度很大;二級培養液接入液體種子后,培養液中菌體在生長過程中形態均一穩定,更多的富馬酸能進入細胞內部與天冬氨酸酶發生反應。因此,針對二級培養液中菌體培養過程中的形態變化、轉化體系中細胞結構變化、是否轉種次數越多越好、又或者其他因素影響、這些問題需要進一步研究探討,也是以后研究的重點和方向,本文暫不做討論。

2.6大腸桿菌HY-05C酶轉化進程對照

在確定大腸桿菌HY-05C的最佳培養基和培養條件以后,菌株HY-05C在20 m3大罐分別以原始和優化后培養條件進行培養,并對其轉化進程進行測定,實驗結果如圖5所示。

圖5　初始培養液和優化后培養液的 游離細胞轉化進程對照Fig.5　The transformation efficiency of original and optimizing growth solution

從圖5中看出,原始培養液轉化天冬氨酸用時約15 h,而優化后的培養液轉化天冬氨酸用時僅需6 h,轉化效率提高150%。從而驗證了通過發酵條件優化提高單位體積的菌體濃度,提高L-天冬氨酸轉化效率方法的可行性。大幅提高了生產效率、設備利用率、降低了生產成本。

3　結論與討論

本研究通過正交實驗對大腸桿菌HY-05C培養基進行優化,獲得最佳培養基配方為(g/L):富馬酸銨10,玉米漿干粉8,酵母粉2,蛋白胨7,氯化鈉5,磷酸二氫鉀1,硫酸鎂0.2,最適pH6.0。與優化前相比,菌株HY-05C的菌體量和天冬氨酸酶活分別提高了44.83%和51%。通過發酵條件優化提高單位體積的菌體濃度,提高L-天冬氨酸轉化效率方法的可行性。通過轉接實驗確定二級種子的最佳接種量為1.0‰,二級培養液的菌體量較原始培養液提高58.33%,酶活較原始培養液提高了105.61%。在上述最佳培養基及培養條件下,對大腸桿菌HY-05C的游離細胞轉化進程進行測定,優化后培養液的轉化效率提高150%,從而驗證了通過發酵條件優化提高單位體積的菌體濃度,提高L-天冬氨酸轉化效率方法的可行性。大幅提高了生產效率、設備利用率、降低了生產成本。

實驗發現,二級培養液L-天冬氨酸酶的酶活提高幅度遠遠大于菌體量的提高幅度。這可能是由于二級培養液菌體培養過程中的細胞形態發生了改變;或者是轉化體系中細胞結構發生改變;又或者是轉種次數多引起的。這些問題值得進一步研究探討,也是以后研究的重點和方向。

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Culture medium and conditions optimization ofL-aspartase-producing strains byEscherichiaColiHY-05C

QIAO Jun1,TIAN Yan-jun1,*,MA Yu-yue2,JIANG Guo-zheng2,ZHAO Xiang-ying1,LIU Jian-jun1

(1.Food & Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province,Jinan 250013,China;2.Yantai Hengyuan Bio-Engineering Co.,Ltd,Yantai 265709,China)

In order to improve the cell concentrations andL-aspartase activity durting theL-asparate production ofEscherichiacoliHY-05C,the culture medium and culture conditions were optimized. First of all,the orthogonal experiment was employed to optimize the medium compositions and the optimal fermentation medium was obtained(g/L):ammonium fumarate 10,corn steep liquor powder 8,yeast powder 2,peptone 7,NaCl 5,KH2PO41,MgSO40.2. Furthermore,the initial pH and inoculum size which had significant influence on bacteria concentration and enzyme activity were investigated,and the optimal pH and inoculum size were determined as 6.0 and 1‰,respectively. Finally,the enzymatic conversion process ofE.coliHY-05C was confirmed using the optimal medium and the culture conditions. Compared with the initial cultual conditons,its conversion efficiency was improved by 150%. Also,it verified the feasibility that the increasing cell concentrations via the optimization of fermentation conditions could enhance the conversion efficiency ofL-asparatase inE.coliHY-05C.

L-aspartic Acid;Escherichiacoli;culture medium;culture condition;enzyme activity;optimization

2015-07-15

喬君(1985-)，男，碩士研究生，中級工程師，研究方向：生物發酵，E-mail：qj851217@126.com。

田延軍(1970-)，男，博士研究生，研究員，研究方向：生物發酵，E-mail:tianyanjun16@163.com。

山東省自主創新專項(2013CXC20601)；山東省泰山學者崗位建設工程經費資助(ts20130919)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0139-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.021