高產γ氨基丁酸乳酸菌菌株的誘變選育與鑒定

雙　全,萬　月,劉　俐

(內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

?

雙全,萬月,劉俐

(內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

本文以從內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的80株乳酸菌為研究對象,在GYP培養(yǎng)基中進行高產γ-氨基丁酸(GABA)菌株的篩選后,利用紫外線進行誘變處理,得到GABA突變菌株,并對其進行了菌種鑒定。結果表明,從80株供試乳酸菌中篩選出4株高產γ-氨基丁酸的菌株,再經紫外誘變后得到1株高產突變菌株US3-3。該菌株紫外誘變后,其γ-氨基丁酸含量為2.482 g/L,是誘變前提高1.9倍,并對其多次傳代穩(wěn)定性較好,經16S rDNA序列分析,鑒定為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

γ-氨基丁酸,乳酸菌,紫外誘變,鑒定

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,簡稱GABA),廣泛存在于自然界中,是人和動物體中非常重要的非蛋白質氨基酸[1],具有降血壓[2]、治療癲癇[3]、抗焦慮[4]等多種生理功能。

γ-氨基丁酸的制備方法有很多種[5],其中微生物合成法因其條件溫和、安全性高而得以廣泛應用于食品生產中。乳酸菌是安全微生物,在食品工業(yè)中應用十分廣泛[6]。國內很多學者研究利用乳酸菌進行發(fā)酵生產GABA,許建軍等通過篩選高產的安全菌種以及優(yōu)化培養(yǎng)條件,GABA的合成水平達到200 g/L以上。Nomura M[7]等從生產奶酪的菌株中分離到Lactococcus lactis 01-7,用于奶酪生產,其GABA含量達到383 mg/kg。2005年Komatsuzakin[8]等從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到1株乳酸菌(Lactobacillusparacasei)NFRI7415,其產GABA的能力達到了302 mmol/L。

本文從供試乳酸菌中篩選出高產GABA的菌株,然后利用紫外線對其進行誘變處理,篩選出高產GABA的誘變菌株,并進行菌種的鑒定,為今后工業(yè)化生產GABA提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳酸菌供試乳酸菌80株(全部乳酸菌由內蒙古農業(yè)大學實驗室提供,從酸菜、酸奶、馬奶酒等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離并初步鑒定的經編號的菌株);MRS培養(yǎng)基蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、酵母粉4 g/L、葡萄糖20 g/L、Tween 80 1 mL/L、磷酸二氫鈉2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、檸檬酸鈉2 g/L、硫酸錳0.02 g/L、硫酸鎂0.1 g/L,調節(jié)pH至6.2左右,121 ℃、15 min滅菌;MRS固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L;GYP種子培養(yǎng)基[7]葡萄糖10 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨5 g/L,無水乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂0.02 g/L、硫酸錳0.01 g/L、氯化鈉0.01 g/L,pH為自然值;GYP發(fā)酵培養(yǎng)基在GYP種子培養(yǎng)基中添加3%的L-谷氨酸鈉、0.4 g/L的維生素B6和0.3%的氯化鈣。

γ-氨基丁酸(含量≥99%)Sigma公司;Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑上海生物工程有限公司;L-谷氨酸鈉國藥集團化學試劑有限公司維生素;B6Sigma公司;氯化鈣國藥集團化學試劑有限公司;四硼酸鈉 硼酸天津市永大化學試劑有限公司;重蒸苯酚國藥集團化學試劑有限公司;次氯酸鈉天津市永大化學試劑有限公司。

SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司;LRH-150系列生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;KDC-140HR臺式高速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司;DSH-300A旋轉式恒溫振蕩器上海雅榮生化設備儀器有限公司;FR980凝膠成像儀上海復日科技儀器有限公司;T6新悅-可見光分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1高產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選將供試乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基活化兩代后,按3%接種至GYP培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)36 h,在12000 r/min下離心15 min,取上清液測定其γ-氨基丁酸的含量(比色法[8-10]),篩選出產量較高的菌株。

1.2.2篩選菌株的紫外誘變

1.2.2.1懸菌液的制備將菌株以3%的接種量接種于GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數(shù)期后,取20 mL菌液離心(3000 r/min,10 min)棄上清液,用無菌生理鹽水沉淀溶解,調整菌數(shù)約為107～108CFU/mL[11],然后進行紫外誘變處理。

1.2.2.2菌株紫外誘變最佳條件的選擇將10 mL調整后懸菌液置于培養(yǎng)皿中,在黑暗條件下,置于30 W紫外燈下35 cm處,分別照射0、20、40、60、80、100、120 s,將照射后的菌液稀釋適當倍數(shù)并平板涂布培養(yǎng)進行菌落計數(shù),計算紫外致死率,選取最佳致死率時間作為誘變計量。

致死率(%)=誘變處理前的總菌數(shù)-誘變處理后存活菌數(shù)/誘變致死前的總菌數(shù)×100

1.2.2.3突變菌株性能穩(wěn)定性的研究采用連續(xù)傳代方法檢測突變菌株遺傳穩(wěn)定性,將篩選出的目的菌株連續(xù)培養(yǎng)7代,測定發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的含量。

1.2.3目的菌株的分子生物學鑒定

1.2.3.1總DNA的提取采用乳酸菌專用CTAB凍融法提取菌株基因組DNA[12]。

1.2.3.2PCR擴增16S rDNA序列擴增引物采用通用引物[13],正向引物為A27F:5′-AGTTTGATCTTGG CTC-3′,反向引物為A1492R:5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′。PCR反應體系:10×PCR緩沖液2.5 μL,正、反引物各0.5 μL,dNTP1 μL,基因組DNA 0.5 μL,酶0.2 μL,雙蒸水補充至25 μL。PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性1 min,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,共進行34個循環(huán),再72 ℃延伸10 min,PCR產物測定由上海生物工程技術公司完成。

1.2.3.3同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建利用BLAST將所測定菌株與數(shù)據庫中已知細菌的16S rDNA序列進行比較,尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。最后利用MEGA軟件進行同源性分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結果與討論

2.1供試菌株產γ-氨基丁酸的能力

市售標準γ-氨基丁酸的標準曲線如圖1。

圖1　γ-氨基丁酸標準曲線Fig.1　Standard curve of γ-Aminobutyric acid

從標準曲線圖1可以看出線性回歸方程為y=0.999x+0.013,相關系數(shù)R2=0.9991。當γ-氨基丁酸濃度在0.20～1.00 mg/mL時呈良好的線性關系。

根據γ-氨基丁酸標準曲線,對80株供試乳酸菌進行初篩和復篩(37 ℃，36 h),獲得4株產γ-氨基丁酸較強的菌株(見表1),并將4株菌株作為出發(fā)菌株進行紫外誘變處理。

表1　篩選各菌株GABA產量Table 1　GABA-production of different strains

2.2出發(fā)菌株紫外誘變最佳條件的確定

將處于最佳菌齡期的高產γ-氨基丁酸的各出發(fā)菌株的菌液制備成107～108CFU/mL的菌懸液,取10 mL調整后懸菌液置于培養(yǎng)皿中,在黑暗條件下,置于紫外燈下照射一定時間(0、20、40、60、80、100、120 s)后得到致死率情況見圖2。

圖2　紫外誘變菌株的致死率曲線圖Fig.2　Lethality curve of strains under UV mutagenesis

根據文獻報道[14],一般把致死率在70%～80%的范圍作為紫外誘變最佳時間。由圖2可知,菌株S3-3、S4-5、Sc6-2和18M376分別在紫外燈下照射60、40、40和80 s時致死率達到菌株發(fā)生正突變的要求。因此確定各出發(fā)菌株進行紫外誘變的最佳條件為:在30 W紫外燈下、照射距離為35 cm,菌株S3-3、S4-5、Sc6-2和18M376分別照射60、40、40和80 s。

2.3篩選菌株紫外誘變效果

將各出發(fā)菌株在最佳紫外誘變的條件下進行多次誘變篩選,γ-氨基丁酸含量變化結果如圖3。

圖3　紫外誘變后各菌株產γ-氨基丁酸的變化圖 Fig.3　The production of γ-Aminobutyric acid of original strains under UV mutagenesis

由圖3可知,4株出發(fā)菌株S3-3、S4-5、Sc6-2和18M376較原始菌株產γ-氨基丁酸的能力均有所提高,其中菌株S3-3由原來的1.293 g/L提高到2.482 g/L,是紫外誘變前的1.9倍,較出發(fā)菌株提高了92%。將突變菌株命名為US3-3。

2.4突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將突變菌株US3-3在GYP培養(yǎng)基上經過連續(xù)7次傳代培養(yǎng),觀察其生長狀態(tài)和產γ-氨基丁酸的能力的穩(wěn)定性,結果見圖4。

圖4　菌株產γ-氨基丁酸穩(wěn)定性測定的結果Fig.4　Genetic stability of GABA-producing strains

由圖4可知,菌株US3-3連續(xù)傳代培養(yǎng)7次后,γ-氨基丁酸的產量仍基本保持穩(wěn)定,含量在2.412～2.513 g/L之間,變化幅度很小,且γ-氨基丁酸的產量得到穩(wěn)定提高,有較好的遺傳穩(wěn)定性,這表明經紫外線誘變后菌株可能發(fā)生了基因突變[15],故將菌株US3-3作為目的菌株進行分子生物學鑒定。

2.5菌株US3-3的16S rDNA擴增與測序

菌株US3-3的16S rDNA的PCR擴增產物用質量分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳結果見圖5。

圖5　菌株的16S rDNA PCR擴增產物Fig.5　16S rDNA PCR amplification of strain US3-3

由圖5可知,突變菌株US3-3在1500 bp左右處出現(xiàn)特異性熒光條帶,能滿足后續(xù)進行16S rDNA序列測定的需要。

2.6菌株US3-3的序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

將目的菌株US3-3的16S rDNA序列與GenBank 數(shù)據庫中已知的7株標準菌序列運用MEGA4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖6。

圖6　基于16SrDNA序列乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6　Dendrogram of lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequence

將菌株US3-3的16S rDNA基因序列與7株標準菌株的基因序列BLAST后發(fā)現(xiàn),該菌株與乳酸片球菌(PediococcusacidilacticiEU147310)的同源性最高。然后將該菌的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據庫中已知的乳酸片球菌近緣菌株進行多序列比較,用MEGA4繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖6),結果表明菌株US3-3與乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)的同源性為100%,因此鑒定該菌株為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

3　結論

以GYP發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵基質,以GABA為測定指標,從80株供試乳酸菌中篩選出4株產γ-氨基丁酸較強的菌株,分別是Sc6-2、18M376、S4-5和S3-3,將其作為紫外誘的出發(fā)菌株。

對4株產γ-氨基丁酸較強的菌株進行紫外誘變處理結果,紫外誘變最佳條件為30 W紫外燈下、照射距離為35 cm,分別照射60、40、40、80 s。

在最佳紫外照射條件下,篩選出一株穩(wěn)定的高產GABA突變菌株US3-3,其γ-氨基丁酸含量為2.482 g/L,是誘變前提高1.9倍。經鑒定菌株US3-3為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

[1]葉惟泠.γ-氨基丁酸的發(fā)現(xiàn)史[J]. 生理科學進展,1968,17(2):187-189.

[2]徐林敏,張充,陸兆新,等.γ-氨基丁酸產生菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化[J].生物工程,2014,23(35):238-239.

[3]LI Haixing,CAO Yusheng. Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid[J]. Amino Acids,2010,39(5):1107-1116.

[4]曾小群,勝嬌鈴,潘道東.新疆算買奶中產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選與鑒定[J].中國食品學報,2013,13(10):191-196.

[5]楊晶晶,曲媛,崔秀明.γ-氨基丁酸的制備方法與含量測定研究進展[J].食品工業(yè)科技,2014,35(3):351-356.

[6]朱曉立,鄧毛程.γ-氨基丁酸乳酸菌分離篩選與微波誘變育種[J].中國釀造,2009,210(9):41-44.

[7]Nomoram,Kmotoh,Someyay. Production of γ-aminobutyric acid by cheese starters during cheese ripening[J]. J Dairy Sci,1998,81(6):1486-1491.

[8]Komatsuzakin,Shimaj,Kawanmotos. Production of γ-aminobutyric acid(GABA)by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermentedfoods[J]. Food Microbiol,2005,22(6)497-504.

[9]Yokoya Sadaji,Hiramatsu Jun-ichi,Hayakawa Kiyoshi. Production ofγ-aminobutyric acid from alcohol distillery less by Lactobacillus brevis IFO-12005[J]. Journal of Biosience and Bioengineering,2001,93(1):95-97.

[10]田東亮.轉化法合成γ-氨基丁酸的霉菌篩選及條件優(yōu)化[D].濟南:齊魯工業(yè)大學,2013.

[11]楊麗麗,趙城彬,吳非.乳酸菌發(fā)酵米糠產γ-氨基丁酸最適條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(16):217-219.

[12]陳恩成,張名位,彭超英,等. 比色法快速測定糙米中γ-氨基丁酸含量研究[J].中國糧油學報,2006,26(1):125-127.

[13]楊春宇.丁醇耐受菌株復合誘變的研究[D].大慶:黑龍江八一農業(yè)大學,2013.

[14]F.奧斯伯,R.布倫特編.顏子穎,王海林譯.精編分子生物學實驗指南[M].北京:科學出版社,1998.

[15]張剛.乳酸菌-基礎、技術和應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2007:174-176.

[16]呂紅線,林建群,林建強.L-乳酸高產菌株的誘變選育[J].中國釀造,2008,185(8):8-10.

[17]Strom K,Sjogren J,Broberg A,et al.LactobacillusplantarumMiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro)and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro)and 3-phenyllactic acid[J]. Appl Environ Microbiol,2002,68(9):4322-4327.

Study on mutation breeding and identification of lactic acid bacteria forγ-aminobutyric acid production

SHUANG Quan,WAN Yue,LIU Li

(Inner Mongolia Agricultural University,College of food science and Engineering,Hohhot 010018,China)

The growth ability of 80 lactic acid bacteria strains isolated from the traditional fermented food in Inner Mongolia were screened according to theγ-aminobuyric acid(GABA)accumulation amount in the GYP medium. The high-yield GABA strains were obtained by ultraviolet mutagenesis,and then the strain was identified by 16S rDNA gene sequences. The results showed that 4 high-yield GABA strains were screened out from 80 strains of lactic acid bacteria and a high yield GABA producing strain US3-3 was obtained by UV mutagenesis and its content of GABA was 2.482 g/L,which was 1.9 times as much as original strain. The strain US3-3 was identified asPediococcusacidilactici.

γ-aminobutyric acid(GABA);lactic acid bacteria;screening;ultraviolet mutagenesis;identification

2015-06-19

雙全(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail：shuangquan@imau.edu.cn。

國家自然科學基金(31460443)。

TS252.5

A

1002-0306(2016)03-0153-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.024