產凝乳酶解淀粉芽孢桿菌的誘變選育

關明玲,李學朋,楊　敏,張忠明,張衛兵,*,師希雄,*

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農業大學理學院,甘肅蘭州 730070)

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產凝乳酶解淀粉芽孢桿菌的誘變選育

關明玲1,2,李學朋1,2,楊敏1,2,張忠明1,張衛兵1,2,*,師希雄1,*

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農業大學理學院,甘肅蘭州 730070)

為了獲得高產凝乳酶菌株,以產凝乳酶解淀粉芽孢桿菌為出發菌株,采用紫外線和硫酸二乙酯進行誘變。誘變后篩選得了一個突變株L-6,凝乳活力為1419.7 SU/mL,比原始菌株提高了40.2%;水解活力降低了22.39%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值為125.64,比出發菌株提高了81.32%。傳代實驗表明,該菌株具有良好的遺傳穩定性。

解淀粉芽孢桿菌,凝乳酶,誘變

誘變育種是指利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群,促進其突變頻率大幅度提高,然后設法采用簡便、快速和高效的篩選方法,從中挑選少數符合育種目的的突變株,以供生產實踐或科學實驗之用[1-3]。微生物常用的誘變方法包括化學誘變、物理誘變、生物誘變和復合誘變[4-8]。紫外誘變是最為常用的一種物理誘變,DNA分子的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后形成嘧啶二聚體,二聚體出現會引起雙鏈結構扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對,從而有可能引起突變或死亡[9-11]。另外二聚體的形成,會妨礙雙鏈的解開,因而影響DNA的復制和轉錄[12]。硫酸二乙酯是一種化學誘變劑,用其進行誘變的特點是快速、安全和高效[13-14]。硫酸二乙酯與紫外誘變結合后具有協同效應,可以使菌種的突變率顯著增加,誘變效果更好,已成功地用于亞硝化單胞菌、產脂肪酶細菌豆豉溶栓酶產生菌的誘變[15-17]。

本實驗室前期成功地利用紫外線和硫酸二乙酯對產凝乳酶地衣桿菌進行了誘變。另外對甘南牧區的產凝乳酶細菌進行篩選,得到一株產凝乳酶的解淀粉芽孢桿菌,其酶活遠遠高于地衣芽孢桿菌[18-19]。本研究以產凝乳酶解淀粉芽孢桿菌為出發菌株,進行紫外線和硫酸二乙酯復合處理,以期篩選凝乳活力較高而水解活力較低的菌株,為細菌凝乳酶的發酵生產奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

表2　紫外誘變的初篩結果Table 2　The result of primary screening by UV

干酪素甘肅華羚生物科技有限公司,食品級;脫脂奶粉完達山乳業股份有限公司,食品級;麩皮蘭州市安寧區桃海市場。硫酸二乙酯,蛋白胨,牛肉膏蘭州嘉特星化學試劑有限公司。

SW-CJ-2FD超凈工作臺蘇州凈化設備廠;HD-E806恒溫振蕩培養箱上海一恒科學儀器有限公司;H1850R冷凍高速離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司。

酪蛋白培養基、牛肉膏蛋白胨液體培養基、產酶培養基參考張衛兵等的方法[18]進行配制。

1.2實驗方法

1.2.1菌懸液的制備將菌種在酪蛋白培養基上活化,然后接種于裝有20 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中,于37 ℃、170 r/min的搖床上振蕩培養15 h,吸取5 mL培養液加入裝有45 mL生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中,在振蕩器上振蕩20 min,將菌體充分打散后得到菌懸液[18]。

1.2.2紫外線誘變處理參考張衛兵[18]等的方法進行紫外線誘變,照射時間分別設定為0、30、60、120、180 s,誘變后計算致死率和正突變率。

致死率(%)=處理前每毫升活菌數-處理后每毫升活菌數/處理前每毫升活菌數×100

1.2.3硫酸二乙酯誘變處理參考張衛兵等的方法進行硫酸二乙酯誘變[18],處理時間分別設定為0、40、50、60、70、80、90 min,誘變后計算致死率和正突變率。

1.2.4突變菌株的篩選參考張衛兵[18]等的方法進行突變菌株的篩選。將突變株活化后,接種于裝液量為20 mL/50 mL的三角瓶中,然后將三角瓶固定于搖床上,37 ℃、140 r/min振蕩培養48 h。培養完成后,將發酵液8000 r/min離心5 min,得到粗酶液,通過測定酶活篩選菌株。

1.2.5突變株的遺傳穩定性將篩選出的菌株連續傳代8次,通過測定酶活力確定菌株的遺傳穩定性。

1.2.6酶活的測定凝乳酶活力的測定采用Arima法[18],蛋白水解活力的測定采用Folin酚試劑法[18]。

1.3數據處理

用SPSS19.0分析軟件對實驗數據進行計算和分析。

2　結果與分析

2.1紫外線誘變的結果

菌株經紫外線照射不同時間后,不同處理時間下致死率和正突變率結果見表1。

由表1可看出,菌株在紫外線處理時,隨照射時間的增加,致死率逐漸增大。照射60 s時致死率達到79.5%;照射120 s時,菌體致死率達到95.3%;照射180 s時,菌體全部死亡。這一變化趨勢與地衣芽孢桿菌的紫外誘變基本相同。紫外處理時,正突變率呈現先增大后減小的趨勢,照射60 s時正突變率最高,可達13.36%。致死率和正突變率的變化趨勢與前期實驗中對地衣芽孢桿菌誘變時基本相同,但最高正變率略低[18]。綜合考慮,在本實驗中選擇60 s作為紫外線誘變的最佳處理時間。

表1　紫外線對菌株的誘變效果Table 1　The effect of UV treatment on the strains

2.2紫外誘變的初篩和復篩結果

菌株誘變后,涂布于分離平板上培養,待長出菌落后測定凝乳圈直徑和菌落直徑,部分菌株的測定結果見表2。

由表2可以看出經過紫外誘變后,菌株的凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的有Z-1、Z-3、Z-4、Z-6、Z-7、Z-10,其中菌株Z-1的增加幅度最大,達8.0%。

選擇凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的菌株,發酵后測定凝乳活力和蛋白水解力,結果見表3。

表3　紫外誘變的復篩結果Table 3　The result of secondary screening by UV

由表3可以看出,凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的幾株菌的凝乳活力均比出發菌株有所提高,其中Z-1凝乳活力提高最大,達到了23.2%。與出發菌株的水解活力相比,Z-1、Z-4、Z-7的水解活力都有所降低,其中Z-4水解活力降低最大,達到了23.9%,Z-1水解活力降低也較大,達到了23.3%。從凝乳活力與蛋白水解活力的比值來看,Z-3和Z-10菌株的酶活比值減小,其余菌株的酶活比值都有所提高,其中Z-1的增幅最大,比出發菌株提高了60.6%。

表5　硫酸二乙酯誘變菌株的初篩結果Table 5　The result of primary screening by diethyl sulfate

表7　突變株DES-6不同代次的凝乳酶活力(SU/mL)Table 7　Milk-clotting activity of mutant DES-6 for different generation(SU/mL)

2.3硫酸二乙酯對菌株的誘變效應

以Z-1為出發菌株,采用硫酸二乙酯誘變后,不同處理時間下致死率和正突變率的結果見表4。

表4　DES的誘變對菌株的影響Table 4　The effect of diethyl sulfate treatment on the strains

由表4可以看出,當處理時間從40 min增加到90 min時,菌體致死率逐漸增大,當處理70 min時菌體的致死率為78.65%,處理90 min時,菌體致死率接近90%。正突變率隨著處理時間的延長先增大后減小,處理70 min時正突變率最高(16.59%)。致死率和正突變率的變化趨勢與前期實驗中對地衣芽孢桿菌誘變時基本相同,說明兩株細菌對硫酸二乙酯的敏感度接近[18]。綜合考慮,在本實驗中選擇60 min為硫酸二乙酯誘變的最佳處理時間。

2.4硫酸二乙酯誘變的初篩及復篩結果

菌株經硫酸二乙酯誘變后,涂布于分離平板上培養,待長出菌落后測定凝乳圈直徑、菌落直徑,部分菌株的測定結果見表5。

由表5可以看出,突變株L-1、L-3、L-4、L-8、L-9和L-10的凝乳圈直徑與菌落直徑比值減小,其余菌株凝乳圈直徑與菌落直徑比值都小幅度增大,L-6的增大幅度最大,比出發菌株增大2.01%。

將凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的菌株發酵后測定凝乳活力和蛋白水解力,結果見表6。

從表6中的測定結果來看,凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的幾株菌的凝乳活力均比出發菌株有所提高,其中菌株L-2、L-6的凝乳活力比出發菌株增大較多,分別比原菌株提高了8.9%和13.9%;菌株的水解活力變化不大,其中L-7水解活力反而比出發菌株增大了9.9%;從凝乳活力與蛋白水解活力的比來看,4株菌的酶活比都有所提高,其中L-6的增幅最大,比出發菌株提高了13.11%。突變株L-6凝乳活力比原始菌株提高了40.2%,水解活力降低了22.39%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值提高了81.32%。

表6　硫酸二乙酯誘變菌株的復篩結果Table 6　The result of secondary screening by diethyl sulfate

2.5突變株的遺傳穩定性

將突變株L-6連續傳代8次,測定每代菌株的凝乳活力,每個代次三個平行,測定結果分別見表7。

由表7可以看出,傳代后菌株的酶活穩定在1417.2～1428.7 SU/mL范圍內,說明不同傳代次數菌株的凝乳酶活力差異不顯著,因而突變株L-6具有穩定的遺傳性。

3　結論

通過實驗確定了解淀粉芽孢桿菌紫外線誘變最佳處理時間為60 s,硫酸二乙酯誘變的最佳處理時間為60 min。紫外誘變后,經篩選得到的突變株Z-1凝乳活力提高了23.2%,水解活力降低了23.3%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值比出發菌株提高了60.6%。

以Z-1為出發菌株,進行硫酸二乙酯誘變后,篩選得到的突變株L-6凝乳活力比原始菌株提高了40.2%,水解活力降低了22.39%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值提高了81.32%。其凝乳活力穩定在1417.2～1428.7 SU/mL,菌株的遺傳性穩定性良好。

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Study on mutation breeding ofBacillusamyloliquefaciensproducing milk-clotting enzyme

GUAN Ming-ling1,2,LI Xue-peng1,2,YANG min2,3,ZHANG Zhong-ming1,ZHANG Wei-bing1,2,*,SHI Xi-xong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu provincial functional dairy engineering laboratory,Lanzhou 730070,China;3.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To obtain an industrial strain with high milk-clotting activity,Bacillusamyloliquefaciensproducing milk-clotting enzyme was mutagenized with ultraviolet and diethyl sulfate. On the basis of multiple mutation,mutant DES-6 was screened. The milk-clotting activity of L-6 reached 1419.7 SU/mL,which was 40.2% higher than that of the parent strain,while the proteolytic activity was reduced by 22.39%. The ratio of milk-clotting activity to proteolytic activity reached 125.64,which was 81.32% higher than that of the parent strain. The pass-generation test indicated that DES-6 had good genetic stability.

Bacillusamyloliquefaciens;milk-clotting enzyme;mutation

2015-04-09

關明玲(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail:270154787@qq.com。

張衛兵(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:zhangwb@gsau.edu.cn。

師希雄(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工，E-mail:shixx@gsau.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31560442)；“十二五”農村領域國家科技計劃項目(2011AA100903)；甘肅省農業科技創新項目(GNCX-2014-31)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0156-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.025