酸脅迫條件下嗜酸乳桿菌菌體細胞酶調節應答反應研究

趙瑞香,王　瑩,袁　崢,梁新紅,牛生洋

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

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酸脅迫條件下嗜酸乳桿菌菌體細胞酶調節應答反應研究

趙瑞香,王瑩,袁崢,梁新紅,牛生洋

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

研究了在極端酸性環境下嗜酸乳桿菌菌體細胞通過自身相關酶活性調節對酸脅迫的應答反應。結果表明,實驗菌株LactobacillusacidophilusInd-1(La-XH1)和LactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2)在酸脅迫條件下,菌體細胞內精氨酸脫亞氨酸酶的酶活升高,pH1.5時La-XH1和La-XH2其酶活分別為4.55、4.13 μg/min·mL;胞內脲酶的活性也有所升高,在酸脅迫條件下(pH1.5)分別是1.33 U和1.26 U。通過對質子泵相關酶酶活的測定,發現在酸脅迫條件下,La-XH1菌體細胞H+-ATPase的酶活隨著pH的降低而升高,pH1.5時酶活為5.49 μmol/min·L,La-XH2無明顯變化,說明存在菌株的差異性;谷氨酸脫酸酶的酶活隨著pH的降低其活性呈上升趨勢,pH1.5時La-XH1和La-XH2的酶活分別為0.336和0.229 mmol/h·L。通過研究表明,嗜酸乳桿菌在酸脅迫條件下可以通過激活相關酶的活性來提高其耐酸性,以維持細胞在極端環境下生理活動的正常進行。

嗜酸乳桿菌,酸脅迫,酶調節,應答反應

嗜酸乳桿菌是棲息在人體腸道內的有益菌之一,當存在一定數量時,它能有效地調節腸道內有益和有害微生物菌群間的平衡,從而促進宿主的健康[1-2]。嗜酸乳桿菌多以發酵乳制品作為載體,在發酵過程中產生的乙酸和乳酸使得乳制品本身具有較低的pH,另外,在食用這些發酵乳制品的時候還要經過胃液的低酸性環境。胃液的pH因飲食結構不同波動很大,通常約為3.0,一般空腹時胃液的pH為1.5,在進食后逐漸上升到3.0～5.0[3]。因此對這些微生物來說,食品和胃中的酸性環境對它們的生存是一個很大的挑戰。大量研究表明,嗜酸乳桿菌的最適pH為6.2,但其具有耐受低pH環境的能力,能夠通過人體胃酸環境而進入腸道定殖下來,從而發揮其健康促進特性[4-5],但其耐酸機理至今尚無定論。

研究發現,L.lactis、L.fermentum、S.thermophilus等[6-8]許多乳酸菌中都有產堿酶的存在,產堿酶主要包括精氨酸脫亞氨酸酶和脲酶。精氨酸脫亞氨酸酶能夠催化L-精氨酸最終生成瓜氨酸、氨和二氧化碳;脲酶能夠催化一分子的尿素水解成一分子的二氧化碳和一分子的氨;這些產堿酶催化底物最終產生的氨會中和細胞內的H+,升高胞內的pH,從而維持胞內pH的平衡以利于生化反應的正常進行[9-10]。研究表明,像L.lactis、L.fermentum、S.thermophilus等這些乳酸菌細胞膜質子泵具有主動排出質子,調節胞內pH的能力,乳酸菌細胞膜質子泵主要包括兩個酶:H+-ATPase和谷氨酸脫羧酶。H+-ATPase為胞膜結合蛋白酶,能夠通過消耗胞體內的ATP,將胞內質子(H+)逆濃度梯度泵出胞外;谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸與一個質子結合生成γ-氨基丁酸,消耗細胞內質子從而引起細胞內pH的增加[9,11]。因此,本研究對嗜酸乳桿菌La-XH1和La-XH2經過不同pH培養進行酸脅迫,探討胞內產堿酶、細胞膜質子動力酶對酸脅迫的應答方應,以期找到產堿酶調節和質子泵調節與嗜酸乳桿菌耐酸能力的關系。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusInd-1(簡稱La-XH1)和LactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2)河南科技學院食品研究所保藏提供,培養基為MRS液體培養基[5]。

溶菌酶(20000 U/mg)上海源聚生物科技有限公司;牛血清蛋白上海源葉生物科技有限公司;鉬酸銨 鄭州博奧化工產品有限公司;γ-氨基丁酸 浙江益萬生物技術有限公司;磷酸吡哆醛 上海譜振生物科技有限公司;L-谷氨酸鈉鄭州鴻祥化工有限公司;考馬斯亮蘭G250 上海化學試劑公司分裝廠等及其他試劑均為分析純。

PHS-3C型pH計上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠;SHP-250型生化培養箱上海三發科學儀器有限公司;JY92-2D超聲波細胞破碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-6型恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電器有限公司;SW-CJ型超凈工作臺蘇凈集團安泰公司;RC5C型高速冷凍離心機美國杜邦公司;7200型可見分光度計尤尼克(上海)儀器有限公司,等。

1.2實驗方法

1.2.1L-瓜氨酸標準曲線的制作取6支干凈試管,按表1添加溶液,并混合均勻,避光沸水浴反應30 min,反應結束后避光冷卻至室溫,在490 nm下測定吸光度,以吸光度為縱坐標,L-瓜氨酸濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.2精氨酸脫亞氨酸酶的活力測定將活化的嗜酸乳桿La-XH1和La-XH2接種于pH為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.2的MRS液體培養基中,37 ℃恒溫培養6 h后,6000 r/min 4 ℃離心收集濕菌體,無菌生理鹽水洗滌兩次,收集菌體備用(以下菌體獲得方法相同)。將所收集的菌體全部轉入5 mL pH為6.5的磷酸緩沖液中,低溫超聲破碎30 min,10000 r/min 4 ℃離心去除菌體碎片,取上清液1 mL,加入1 mL的L-精氨酸溶液,振蕩10 min,二乙酰一肟測定轉化液中新生成的L-瓜氨酸的量[12-13]。

表1　L-瓜氨酸標準曲線溶液配制Table 1　Preparation of L-citrulline standard curve

精氨酸脫亞氨酸酶酶活的定義:在1 min內催化L-精氨酸產生1 μg的L-瓜氨酸所需的酶量定義為一個酶活單位,即μg/min·mL。

1.2.3脲酶的活力測定按照1.3.2方法收集的菌體轉入5 mL pH為7.0的磷酸緩沖液中,低溫超聲破碎30 min,10000 r/min離心去除菌體碎片,取上清液1 mL于試管中,加入10 mL的尿素緩沖液,迅速蓋上塞子,劇烈搖動。將試管置于30 ℃的恒溫水浴鍋中,保持30 min。

另取1 mL上清液放入另一支試管中,加入10 mL pH7.0的磷酸緩沖液,迅速蓋上塞子,將試樣與緩沖液混合均勻,置于水浴鍋中保持30 min,作為空白。每隔5 min將試樣搖勻一次。每個試管保持30 min后,從水浴鍋中取出,將上清液倒入小燒杯中。并在從水浴鍋中取出恰好5 min時,測pH[14-15]。

脲酶活性計算公式:UA=pH″-pH0

式中:UA-脲酶活性,單位計作U;pH″-尿素分解后樣液的pH;pH0-空白樣液的pH。

1.2.4H+-ATPase活性測定

1.2.4.1H+-ATPase粗酶液的制備將經過6 h 37 ℃恒溫培養的La-XH1和La-XH2以8000 r/min,4 ℃低溫離心收集濕菌體,并用預冷的MgCl2溶液洗滌得濕菌體,加入pH7.2的甘氨酰-甘氨酸-KOH-MgCl2的混合緩沖液至菌體懸濁,然后加入溶菌酶50 mg,40 ℃水浴中恒溫1 h。離心后,在沉淀中加入40 ℃的MgCl2溶液,40 ℃水浴30 min,離心除去未破碎的細胞,收集細胞膜。然后加入MgCl2緩沖液懸濁,并用Protein Assay試劑測定蛋白質含量,直到MgCl2緩沖液稀釋的蛋白質質量濃度為100 μg/mL為止,制成粗酶液[16]。

1.2.4.2游離磷酸標準曲線制作在500 μL反應液中添加0、20、40、60、80、100 μmol/L的KH2PO4溶液200 μL,37 ℃下反應10 min,然后加入300 μL預冷的0.1 mol/L HCl終止反應。反應液在冰浴中放置10 mim后加入2 mL的發色液,18 ℃條件下發色10 min,立即在660 nm測定其吸光度,繪制標準曲線。

1.2.4.3H+-ATPase活力測定500 μL反應液中添加100 μL 的粗酶液,用上面同樣的方法測定吸光度,并用沸水浴30 min滅酶活的粗酶液作為空白。參考標準曲線,以1 min內1 μmol的游離磷酸量表示1個酶活單位,即μmol/min·L[17-18]。

1.2.5谷氨酸脫酸酶的活力測定

1.2.5.1谷氨酸脫酸酶粗酶液的制備將經過6 h 37 ℃恒溫培養的菌體于4 ℃下8000 r/min離心收集濕菌體,生理鹽水洗滌2次離心收集菌體,加入20 mL pH4.8含1 mmol/L的巰基乙醇和0.1 mmol/L磷酸吡哆醛的混合緩沖液,冰浴中超聲破碎,收集上清液,并于混合緩沖液中充分透析,離心收集上清液,作為谷氨酸脫羧酶的粗酶液。

1.2.5.2γ-氨基丁酸標準曲線制作分別取400 μL濃度分別為0、2、4、6、8、10 mmol/L的γ-氨基丁酸標準溶液,加入pH10.0 0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液500 μL、1 mol/L Na2CO3溶液100 μL、6%苯酚1 mL,混勻,加入NaClO溶液(活性氯為5.2%)1 mL,混勻后放置10 min,然后沸水浴10 min,立即冰浴20 min,待溶液出現藍色后,加入2.0 mL 60%乙醇溶液,混勻后于20 ℃水浴中放置20 min,在630 nm測定吸光值,繪制γ-氨基丁酸標準曲線。

1.2.5.3谷氨酸脫酸酶酶活的測定取1 mL粗酶液、1 mLL-谷氨酸溶液(60 mmol/L,pH4.8)和1 mL混合緩沖液,混勻后于40 ℃反應10 h,取出置冰浴終止反應,用上述方法測定630 nm處吸光度,根據標準曲線計算γ-氨基丁酸濃度。用沸水浴30 min滅酶活的谷氨酸脫酸酶粗酶液作為空白。以1 h內1 mmol的γ-氨基丁酸作為一個酶活單位,即mmol/h·L[19-20]。

2　結果與分析

2.1L-瓜氨酸標準曲線

由圖1可以看出,L-瓜氨酸在0～50 μg/mL范圍內,L-瓜氨酸濃度與吸光度具有良好的線性關系,線性方程:y=0.0112x+0.0069,R2=0.998,線性關系較好,可以作為L-瓜氨酸濃度的標準曲線。

圖1　L-瓜氨酸標準曲線Fig.1　The standard curve of L-citrulline

2.2酸脅迫下精氨酸脫亞氨酸酶活性調節應答反應

將不同pH下培養的La-XH1和La-XH2菌體用二乙酰一肟測定轉化液中新生成的L-瓜氨酸的量,然后根據標準曲線計算出精氨酸脫亞氨酸酶的活力,結果見圖2、圖3。

圖2　不同pH下La-XH1的精氨酸脫亞氨酸酶的活力Fig.2　The arginine deiminase activity of La-XH1 at different pH

圖3　不同pH下La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的活力Fig.3　The arginine deiminase activity of La-XH2 at different pH

由圖2、圖3可以看出,pH為1.5時,La-XH1、La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活較高,分別為4.55 μg/min·mL和4.13 μg/min·mL;pH為6.2時,La-XH1、La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活較低,分別為0.32 μg/min·mL和0.62 μg/min·mL;與pH6.2相比,pH1.5時,La-XH1的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活上升了13倍,La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活上升了近6倍。說明酸脅迫激活了精氨酸脫亞氨酸酶的活性,胞內精氨酸脫亞氨酸酶活性的提高,催化L-精氨酸產氨,中和細胞內的H+,從而維持胞內pH平衡和正常生化反應,以提高自身在低pH環境下的生存能力。

2.3酸脅迫下脲酶活性調節應答反應

脲酶又稱酰胺水解酶或尿素酶,能夠催化尿素水解,產生氨和二氧化碳,是一種高效的分解尿素催化劑,自然界中,細菌、真菌和植物都能合成脲酶,脲酶有助于微生物利用內源性和外源性尿素作為氮源,并將其分解產生氨,而氨可以中和H+,升高胞內的pH,維持細胞在低pH條件下的相對穩定[10,21]。實驗在將不同pH下培養La-XH1和La-XH2,通過pH增值法測得脲酶的活力如圖4、圖5。

圖4　不同pH下La-XH1的脲酶的活力Fig.4　The cellular urease activity of La-XH1 at different pH

圖5　不同pH下La-XH2的脲酶的活力Fig.5　The cellular urease activity of La-XH2 at different pH

由圖4、圖5可以看出,嗜酸乳桿菌La-XH1和La-XH2在不同pH條件下培養時,胞內的脲酶活性變化不大,pH1.5時酶活與最適pH6.2相比有一定的升高,分別是1.33 U和1.26 U,在最適pH6.2條件下培養時,胞內的脲酶活性較低,分別為0.82 U和0.79 U,說明脲酶在嗜酸乳桿菌的酸適應過程中作用不太明顯。脲酶能夠催化尿素水解,產生氨和二氧化碳,而氨可以中和H+,升高胞內的pH,維持細胞在低pH條件下的相對穩定[22]。

2.4游離磷酸標準曲線

由圖6可以看出,在0～100 μmol/L范圍時,游離磷酸濃度與吸光度呈線性關系:y=0.0072x-0.011,R2=0.9938,線性關系良好,可作為游離磷酸標準曲線。

圖6　游離磷酸標準曲線Fig.6　Standard curve of free phosphoric acid

2.5酸脅迫下H+-ATPase酶活性調節

質子泵在乳酸菌維持胞內外pH的相對穩定時發揮了重要作用,其原理是依賴于ATP水解釋放的能量逆濃度梯度轉運氫離子。H+-ATPase和谷氨酸脫羧酶是質子泵機制的兩個主要酶。H+-ATPase每逆向轉移一分子的質子,就要消耗一分子ATP產生一分子游離磷酸,通過測定生成游離磷酸的量可知H+-ATPase的活性[23]。因此,實驗首先在不同pH下培養La-XH1和La-XH2,測定其H+-ATPase逆向轉運質子消耗ATP生成的游離磷酸的量,然后根據標準曲線計算出H+-ATPase的酶活,如圖7、圖8。

圖7　不同pH下La-XH1的H+-ATPase的酶活Fig.7　The H+-ATPase activity of La-XH1 at different pH

圖8　不同pH下La-XH2的H+-ATPase的酶活Fig.8　The H+-ATPase activity of La-XH2 at different pH

由圖7、圖8可以看出,La-XH1的H+-ATPase酶活最適pH6.2時為2.81 μmol/min·L,pH1.5時為5.49 μmol/min·L,酶活增加了近1倍,說明耐酸菌株La-XH1酸脅迫下H+-ATPase活性調節在酸適應過程中發揮了作用,原因是H+-ATPase可以通過消耗胞內ATP水解釋放的能量,將胞內質子(H+)逆濃度梯度泵出胞外,以維持胞內pH的近中性。La-XH2的H+-ATPase的酶活在pH1.5與pH6.2時則無明顯變化,說明La-XH1和La-XH2存在菌株差異性[24-25]。

2.6γ-氨基丁酸標準曲線

由圖9可知,在γ-氨基丁酸濃度為0～10 mmol/L范圍時,吸光度與濃度呈線性關系:y=0.0794x+0.022,R2=0.9983,線性關系較好,可作為γ-氨基丁酸濃度的標準曲線。

圖9　γ-氨基丁酸標準曲線Fig.9　Standard curve of γ-Amino butyric acid

2.7酸脅迫下谷氨酸脫酸酶酶活性調節應答

谷氨酸脫羧酶可以催化L-谷氨酸與一個質子結合生成γ-氨基丁酸,消耗細胞內的質子從而使細胞內得pH的升高,它廣泛存在于動物、植物和微生物中。實驗在不同pH下培養La-XH1和La-XH2,測定其在酸脅迫條件下γ-氨基丁酸的生成量,然后根據標準曲線計算谷氨酸脫酸酶的酶活,結果如圖10、圖11。

圖10　不同pH下La-XH1的谷氨酸脫酸酶的酶活Fig.10　The glutamate decarboxylase activity of La-XH1 at different pH

圖11　不同pH下La-XH2的谷氨酸脫酸酶的酶活Fig.11　The glutamate decarboxylase activity of La-XH2 at different pH

由圖10、圖11可以看出,嗜酸乳桿菌La-XH1和La-XH2的谷氨酸脫酸酶的酶活在最適pH6.2時,其活性較小,酶活單位分別為0.053 mmol/h·L和0.016 mmol/h·L,隨著pH降低,酶活增大,pH1.5時La-XH1和La-XH2活性分別達到0.336 mmol/h·L和0.229 mmol/h·L,較最適pH6.2下酶活分別升高了約5倍和13倍。另外,相同pH下,La-XH1的酶活較La-XH2的大,說明存在菌株的差異性。嗜酸乳桿菌通過激活谷氨酸脫酸酶的活性來提高其耐酸能力,主要是經過谷氨酸脫羧酶消耗胞內質子,L-谷氨酸消耗一分子H+分解為γ-氨基丁酸和CO2,升高胞內的pH,從而維持細胞內的酸堿平衡[26-27]。

3　結論

嗜酸乳桿菌是人體腸道內重要益生菌,具有較強耐酸性。當環境中的pH低于細胞生長的最適pH時,嗜酸乳桿菌維持胞內pH相對穩定的能力是其在極端環境下能夠存活的重要生理功能之一。通過本實驗研究表明,嗜酸乳桿菌的這種能力與菌體細胞自身酶活性的調節密不可分,通過酶調節維持菌體細胞一種寬范圍的△pH,使胞內pH高于環境的pH,以維持細胞正常生理活動的進行。產堿酶的存在能催化精氨酸和尿素分解產生中和細胞內的H+的氨,從而維持胞內pH的相對穩定。在酸脅迫條件下(pH1.5),嗜酸乳桿菌細胞內的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活升高,與最適pH6.2相比,La-XH1和La-XH2精氨酸脫亞氨酸酶的酶活分別上升了13倍和近6倍,胞內的脲酶活性變化沒有精氨酸脫亞氨酸酶的活性變化大,但與最適pH6.2相比,也有所升高;通過對質子泵相關酶酶活的測定,發現在酸脅迫下La-XH1的H+-ATPase的酶活隨著pH的降低而升高,耐酸菌株與最適pH下的菌株H+-ATPase的酶活相差近1倍,La-XH2無明顯變化,說明存在菌株的差異性;谷氨酸脫酸酶的酶活隨著pH的降低其活性呈上升趨勢,pH1.5時的酶活比最適pH6.2時的酶活La-XH1和La-XH2分別升高了約5倍和13倍。總之,在酸脅迫時,嗜酸乳桿菌可以通過激活精氨酸脫亞氨酸酶、脲酶、H+-ATPase酶、谷氨酸脫酸酶等酶的活性來提高其耐酸性,以維持細胞在極端環境下生理活動的正常進行。

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Response reaction of enzyme regulation byLactobacillusacidophiluscell on acid-stress

ZHAO Rui-xiang,WANG Ying,YUAN Zheng,LIANG Xin-hong,NIU Sheng-yang

(College of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The response reaction ofLactobacillusacidophiluscell on acid-stress through the related enzyme regulation in extremely acidic environment were studied. The result showed that the enzymatic activity of intracellular arginine deiminase of test strains,LactobacillusacidophilusInd-1(La-XH1)andLactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2),was increased to 4.55 μg/min·mL and 4.13 μg/min·mL respectively at pH1.5.The intracellular urease activity of La-XH1 and La-XH2 was 1.33 U and 1.26 U,which were increased slightly. By analyzing the enzyme activity related to proton pump,the result showed that the H+-ATPase activity of La-XH1 was increased with the decrease of pH,and enzyme activity was 5.49 μmol/min·L at pH1.5. However,the H+-ATPase activity of La-XH2 had no significant change,which indicated La-XH1 and La-XH2 had strain differences. Meanwhile,the enzyme activity of glutamate decarboxylase had an increasing tendency with the decrease of pH,and the enzyme activity of La-XH1and La-XH2 was 0.336 mmol/h·L and 0.229 mmol/h·L respectively at pH1.5. The study indicated thatLactobacillusacidophiluscould activate the enzyme activity related to improve its acid-resistant ability on acid-stress condition,in order to maintain the normal physiological function of cells in extreme environment.

Lactobacillusacidophilus;acid-stress;enzyme regulation;response reaction

2015-07-09

趙瑞香(1966-)，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：zrx338@163.com。

河南省教育廳科學技術研究重點項目(12A550004)；河南省科技攻關計劃項目(122102110117)；新鄉市科技創新平臺建設項目(CP1310)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0181-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.030