米黑毛霉酶凝干酪素生產工藝參數的優化研究

李學朋,關明玲,趙保堂,楊　敏,文鵬程,張忠明,張衛兵,*,師希雄,*

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農業大學理學院,甘肅蘭州 730070)

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米黑毛霉酶凝干酪素生產工藝參數的優化研究

李學朋1,2,關明玲1,2,趙保堂1,楊敏1,2,文鵬程1,2,張忠明1,張衛兵1,2,*,師希雄1,*

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農業大學理學院,甘肅蘭州 730070)

以新鮮牛乳為原料,采用米黑毛霉凝乳酶為凝乳劑,先通過單因素實驗研究凝乳酶添加量、CaCl2添加量、凝乳pH、凝乳溫度對酶凝干酪素得率的影響,然后通過響應面設計進一步優化了米黑毛霉酶凝干酪素生產工藝參數。優化得到的最佳工藝參數為:凝乳酶添加量0.49%、CaCl2添加量0.37 mg/mL、凝乳pH6.08、凝乳溫度35 ℃,在此條件下酶凝干酪素的得率可達3.39%。研究結果可為米黑毛霉凝乳酶在干酪素生產中的應用提供參考。

米黑毛霉,酶凝干酪素,工藝優化

酪蛋白是牛乳中一大類含磷蛋白的總稱,含量約為總蛋白的80%[1]。在脫脂牛乳中加入凝乳酶,則可將酪蛋白分離沉淀出來,通過這種方法獲得的酪蛋白產品為凝乳酶干酪素[2]。凝乳酶干酪素是一種蛋白含量較高的干酪素,具有良好的融化性、拉伸性、凝膠性并且有較強的染色附著力和抗擠壓力,廣泛應用于食品、醫藥、機械制造、皮革、紡織、塑料等行業[3-9]。凝乳酶干酪素生產中起關鍵作用的凝乳酶主要包括動物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶等[10-11]。小牛皺胃酶是最為常用的動物凝乳酶,用其生產干酪素得率較高、品質較好,但來源有限、成本較高,隨著經濟發展通過宰殺犢牛來獲得凝乳酶,已無法滿足工業化發展的需求[12]。植物凝乳酶雖然在成本上有一定優勢,但因蛋白水解活力高,在乳制品加工中常出現苦澀感。同時要受到時間、生長周期等諸多條件限制，因此發展有一定的局限性。微生物凝乳酶具有來源廣泛、提取方便、經濟效益高等的特點,是小牛皺胃酶較有潛力的替代品[13-14]。

米黑毛霉是微生物中產凝乳酶活力較高的真菌,目前關于其產酶條件、酶學性質的研究較多,但有關米黑毛霉凝乳酶在干酪素生產中應用的報道尚未見到。本實驗以新鮮牛乳為原料,首先采用單因素實驗研究凝乳酶添加量、CaCl2添加量、凝乳pH、凝乳溫度對凝乳效果的影響,并通過響應面法優化凝乳工藝及參數,探討工藝參數對干酪素得率的影響,為工業化生產微生物凝乳酶干酪素生產提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮牛乳甘肅農業大學奶牛場;米黑毛霉凝乳酶采用本實驗室米黑毛霉發酵制備[15],凝乳酶活力為2700 SU/mL;脫脂奶粉內蒙古伊利實業集團股份有限公司。

氯化鈣、鹽酸等試劑均為分析純。

AL204 電子天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司;HWS26 型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司;TDD5M 低速離心機長沙平凡儀器儀表有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫療器械有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1干酪素生產工藝流程參照甘伯中[16]等人的方法并改進。

新鮮牛乳→脫脂→巴氏殺菌→添加CaCl2、凝乳酶凝乳→切割→加熱收縮→排乳清→洗滌→干燥→粉碎→成品

操作要點:

(1)脫脂:將原料乳加熱至38～40 ℃進行離心脫脂(4000 r/min,15 min)除去脂肪以及雜質;

(2)巴氏殺菌:63～65 ℃,30 min;

(3)凝乳:根據實驗設計中不同凝乳酶添加量添加凝乳酶,適當攪拌后凝乳;

(4)切割:待完成凝乳后,用刀將凝塊切為方塊。

(5)加熱、排乳清:緩慢升溫至60 ℃并不斷攪拌,控制加熱時間為30 min,之后除去乳清;

(6)洗滌:加入與脫脂乳等體積的50 ℃水清洗凝乳粒,反復操作3次;

(7)干燥:鼓風干燥箱中45 ℃烘干5 h;

(8)粉碎:利用粉碎機將干燥后的干酪素粉碎。

1.2.2凝乳酶活力測定采用Arima法[17]。

1.2.3干酪素得率的測定參照劉佳[18]等人的方法。

得率(%)=酶凝干酪素質量/原料乳質量×100

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1凝乳酶添加量對干酪素得率的影響取200 mL巴氏殺菌后的脫脂乳,調整 pH為 6,加入CaCl2的量為0.3 mg/mL,添加凝乳酶的量(v/v)分別設定為0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%,調節凝乳溫度為40 ℃,適當攪拌后,保溫 30 min,凝乳后洗滌、干燥,稱重并計算得率。

1.2.4.2CaCl2添加量對干酪素得率的影響取200 mL巴氏殺菌后的脫脂乳,調整 pH為 6.0,同時分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的CaCl2,添加1%的凝乳酶,調節凝乳溫度為 40 ℃,適當攪拌后,保溫 30 min,凝乳后洗滌、干燥,稱重并計算得率。

1.2.4.3凝乳pH對干酪素得率的影響取200 mL巴氏殺菌后的脫脂乳,將pH分別調整為 5.8、6.0、6.2、6.4、6.6,加入CaCl2的量為0.3 mg/mL,添加1%的凝乳酶,調節凝乳溫度為 40 ℃,適當攪拌后,保溫 30 min,凝乳后洗滌、干燥,稱重并計算得率。

1.2.4.4凝乳溫度對干酪素得率的影響取200 mL巴氏殺菌后的脫脂乳,調整pH為6.0,并加入CaCl2的量為0.3 mg/mL,添加1%的凝乳酶,調節凝乳溫度分別為 25、30、35、40、45 ℃,適當攪拌后,保溫 30 min,凝乳后洗滌、干燥,稱重并計算得率。

1.2.5響應面設計與數據分析利用Design-Expert 7.0軟件進行設計和分析。以單因素實驗為基礎,采用Box-Behnken實驗設計進一步優化米黑毛霉凝乳酶干酪素生產工藝參數。選取影響凝乳特性的4個因素為:凝乳酶添加量(A)、CaCl2添加量(B)、凝乳pH(C)、凝乳溫度(D)。每一個因素水平分別以-1、0、1編碼,以得率為響應值。實驗因素及水平設計見表1,實驗設計及結果見表2。

表1　響應面實驗設計因素水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6數據分析利用Design-Expert 7.0軟件進行設計和分析。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.1.1凝乳酶添加量對干酪素得率的影響不同米黑毛霉凝乳酶的添加量對干酪素得率的影響如圖1。由圖1可以看出,酶添加量對干酪素的得率影響較大。在凝乳酶添加量為0.25%時,干酪素的得率較低為2.92%;當凝乳酶的添加量為0.5%時,干酪素的得率達到最大(3.15%);此后干酪素得率顯著下降,當酶添加量為1.25%時,干酪素的得率下降至2.57%。這是因為凝乳效果對干酪素的得率有直接作用,酶濃度較低時凝乳較慢,形成的凝乳較軟、易碎,水洗時損失較大,而酶濃度過高時凝乳速度加快,但是形成的凝塊彈性差、易碎,水洗時損失也較大,因而使干酪素的得率降低[18]。因此,米黑毛霉凝乳酶的添加量選擇0.5%。

圖1　酶添加量對干酪素得率的影響Fig.1　Effect of chymosin addition amount on product yield

2.1.2CaCl2添加量對干酪素得率的影響鈣離子主要影響酪蛋白酶凝過程的非酶反應階段,它會在副酪蛋白分子間形成“鈣橋”,使副酪蛋白的微粒發生團聚作用而產生凝膠體。鈣離子濃度較低時,鈣橋形成不完全,從而影響凝乳效果[18]。由圖2可知,當添加氯化鈣為0.1 mg/mL時,干酪素的得率為2.6%;隨著氯化鈣添加量的增加,干酪素得率迅速增加,當添加氯化鈣0.3～0.4 mg/mL時,干酪素得率變化不大,此后干酪素得率緩慢下降。綜上所述,選擇添加氯化鈣范圍為0.3～0.4 mg/mL。

圖2　氯化鈣添加量對干酪素得率的影響Fig.2　Effect of CaCl2 addition amount on product yield

2.1.3凝乳pH對干酪素得率的影響凝乳pH會影響酶和底物的解離狀態和電荷平衡,適宜的pH可以減弱它們之間的排斥作用,改善凝乳效果,從而提高干酪素的得率。過高的pH會影響酶的結構,甚至使酶變性而失活,從而影響凝乳效果并使干酪素得率下降[19]。凝乳pH對干酪素得率的影響如圖3所示。當pH為5.8時,得率較低,為2.49%;此后隨著凝乳pH的升高,干酪素得率呈上升趨勢,當凝乳pH升至6.2時,得率最大為3.09%;當pH繼續增加,干酪素得率迅速下降。因此選擇 pH6.2為最適凝乳條件,在此條件下形成的凝塊細膩、硬度適宜、彈性好、不易碎,乳清中損失的蛋白質少。

圖3　凝乳pH對干酪素得率的影響Fig.3　Effect of curd pH on product yield

2.1.4凝乳溫度對干酪素得率的影響凝乳溫度對干酪素得率有一定的影響,溫度較低時酶促反應較慢,凝乳不完全,另外形成的凝乳較軟易碎,在后期洗滌過程中會有一定損失導致得率下降。溫度過高時會導致酶失活,從而失去凝乳效果[20]。凝乳溫度對干酪素得率的影響如圖4所示。由圖4可以看出,當凝乳溫度低于35 ℃時,干酪素的得率隨著溫度升高逐漸增大;當溫度升高至35 ℃時,干酪素得率達到最大(3.06%);此后隨著溫度的升高,干酪素得率逐漸減小,45 ℃時迅速降低為2.79%,說明此時酶活損失較多,影響了凝乳效果。因此,凝乳溫度選擇35 ℃。

圖4　凝乳溫度對干酪素得率的影響Fig.4　Effect of curd temperature on product yield

2.2響應面分析

根據 Box-Behnken 設計,響應面分析實驗共進行了29組實驗,其結果如表2所示。利用Design Expert 7.0 軟件對表2實驗數據進行多元回歸擬合,得到回歸方程如下:

R=-17.17+6.54A-0.80B+5.83C+0.16D-0.01AB+0.85AC-0.002AD+0.21BC-0.0005BD+0.0025CD-11.89A2-0.063B2-0.59C2-0.0025D2

表3　回歸方程的方差分析結果Table 3　Regression equation of the results of variance analysis

由表3可以看出,模型中A、AC、BC、A2、B2、D2為顯著因素,說明酶添加量、氯化鈣添加量、pH、凝乳溫度對干酪素得率都有一定影響,且它們之間的關系不是線性關系。通過分析回歸系數可知影響干酪素得率的各因素的主次順序為:酶添加量>pH>凝乳溫度>氯化鈣添加量。同時由表3可以看出酶添加量和pH、氯化鈣添加量和pH之間的交互作用較顯著,而其它幾個因素間的交互作用不顯著。

2.3最優工藝條件的確定及驗證實驗

采用 Design-Expert 軟件預測得到干酪素得率的最大估計值為 3.44%,此時A、B、C、D四個因素對應的水平為:凝乳酶添加量為0.49%、CaCl2添加量為0.37 mg/mL、凝乳pH6.08、凝乳溫度34.48 ℃。

為檢驗預測結果的可靠性,采用上述優化條件進行驗證實驗。為了在實際中操作方便,將凝乳溫度修正為35 ℃,其它條件不變,進行3次驗證實驗,實驗得出的平均得率為3.39%,與預測值差異不顯著,說明優化實驗的結果是可靠的。

實驗得到的干酪素產品如圖5所示,干燥前色澤為白色,凝塊質地適中,有彈性(圖5a);干燥后的凝乳顆粒表面色澤為淺黃色,內為白色(圖5b);顆粒粉碎后干酪素產品為均一的白色粉末(圖5c)。

圖5　米黑毛霉凝乳酶干酪素產品Fig.5　Rennet casein with milk-clotting enzyme from Mucor miehei注:a.干燥前干酪素產品;b.干燥后干酪素產品; c.干燥粉碎后干酪素產品。

3　結論

通過單因素實驗,Box-Behnken實驗設計對米黑毛霉凝乳酶干酪素生產中凝乳工藝進行了優化,得出4個因素對干酪素得率影響大小依次為:凝乳酶添加量>凝乳pH>凝乳溫度>氯化鈣添加量。通過優化后得到的最佳凝乳工藝參數為:凝乳酶添加量為0.49%、CaCl2添加量為0.37 mg/mL、凝乳pH6.08、凝乳溫度35 ℃。在此條件下,酶凝干酪素的理論得率為3.44%,驗證實驗的得率為3.39%,兩者差異不顯著。實驗得到的干酪素產品為白色粉末。

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Research of the optimization in parameters of casein production with milk-clotting enzyme fromMucormiehei

LI Xue-peng1,2,GUAN Ming-ling1,2,ZHAO Bao-tang1,YANG Min1,2,WEN Peng-cheng1,2,ZHANG Zhong-ming1,ZHANG Wei-bing1,2,*,SHI Xi-xong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2. Gansu Provincial Functional Dairy Engineering Laboratory,Lanzhou 730070,China;3. College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Fresh milk was selected as the raw material andMucormieheichymosin was used as the coagulant to prepare rennet casein. First,the effects of addition volume of enzyme and CaCl2,pH and temperature on the yield of rennet casein were studied using the single factor experiment. Subsequently,the technological parameters of casein production with milk-clotting enzyme fromMucormieheiwere further optimized by Box-Behnken design. The results showed the optimum technological parameters were chymosin addition amount of 0.49%,CaCl2addition amount of 0.37 mg/mL,pH6.08 and curd temperature of 35 ℃. Under the optimal conditions,the maximum yield of rennet casein was 3.39%. The study could provide reference basis for the full utilization ofMucormieheichymosin in the production of rennet casein.

Mucormiehei;rennet casein;process optimization

2015-07-13

李學朋(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail:1101266997@qq.com。

張衛兵(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:zhangwb@gsau.edu.cn。

師希雄(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工，E-mail:shixx@gsau.edu.cn。

甘肅省農業科技創新項目(GNCX-2014-31)；國家自然科學基金項目(31560442)；“十二五”農村領域國家科技計劃項目(2011AA100903)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.032