解淀粉芽孢桿菌Z16的產酶條件優化及應用

曾　誠,馬毛毛,肖彥駿,3,*,曾哲靈,余　平,鐘衛民

(1.南昌大學 第一臨床醫學院,江西南昌 330031;2.南昌大學 生命科學學院,江西南昌 330031;3.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;4.南昌大學 資源環境與化工學院,江西南昌 330031;5.撫州職業技術學院,江西撫州344106)

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解淀粉芽孢桿菌Z16的產酶條件優化及應用

曾誠1,馬毛毛2,肖彥駿2,3,*,曾哲靈3,4,余平4,鐘衛民5

(1.南昌大學 第一臨床醫學院,江西南昌 330031;2.南昌大學 生命科學學院,江西南昌 330031;3.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;4.南昌大學 資源環境與化工學院,江西南昌 330031;5.撫州職業技術學院,江西撫州344106)

本文采用單因素實驗和正交實驗,對解淀粉芽孢桿菌Z16的產酶條件及水酶法提取樟樹仁油工藝條件進行優化,并與枯草芽孢桿菌AS1.398的水酶法提取樟樹籽仁油工藝進行比較。結果表明,解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發酵培養基為:玉米粉4.5%,麩皮2.5%,豆粕4.0%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,121 ℃滅菌20 min;解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發酵條件為:接種量2%,37 ℃、220 r/min,搖瓶培養44 h。在最佳產酶工藝條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16所產中性蛋白酶活力為6984.3 U/mL,比產酶條件優化前提高了54.0%。解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油的最適酶解時間為4 h、最適加酶量為20%(v/v),相應的樟樹籽仁油得率為91.1%、樟樹籽仁油的酸價升高值只有0.3 mg KOH/mL。解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油的效果顯著優于枯草芽孢桿菌AS1.398(常用的中性蛋白酶生產菌)的效果。

解淀粉芽孢桿菌,中性蛋白酶,樟樹籽仁油,水酶法

樟樹籽仁油的中碳鏈脂肪酸甘油酯含量高于94%,具有減少體內脂肪沉積、降低血脂和血糖水平等作用[1-2]。中碳鏈脂肪酸甘油酯對枯草芽孢桿菌AS1.398等革蘭氏陽性菌、霉菌及其所產生物酶具有較強的抑制作用[3-6]。水酶法提取油脂中使用的蛋白酶基本上是枯草芽孢桿菌AS1.398、棲土曲霉3942、放線菌166等菌株所生產的[7-8]。采用這些菌株所產的蛋白酶應用于樟樹籽仁油的提取,其得率小于83%,酸價大于5 mg KOH/g。解淀粉芽孢桿菌Z16是產中性蛋白酶能力強、產脂肪酶能力很弱的耐中碳鏈脂肪酸型菌株,該菌株的產中性蛋白酶能力[9],比近年來文獻報道的枯草芽孢桿菌N19[10-11]、枯草芽孢桿菌Bx-4[12]的產蛋白酶能力高很多,也高于國內常用于生產中性蛋白酶制劑的出發菌株——枯草芽孢桿菌AS1.398、棲土曲霉3942、放線菌166的產蛋白酶能力[13]。而解淀粉芽孢桿菌Z16的產脂肪酶活力大幅低于國內常用于生產中性蛋白酶制劑的出發菌株的產脂肪酶能力[9]。因此,解淀粉芽孢桿菌Z16適用于水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂。本文對解淀粉芽孢桿菌Z16的產酶條件及水酶法提取樟樹籽仁油工藝條件進行優化,實現樟樹籽仁油的水酶法提取。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌Z16課題組篩選獲得;枯草芽孢桿菌AS1.398中國工業微生物菌種保藏管理中心;肉湯培養基蛋白胨1 g,牛肉膏0.3 g,NaCl 0.5 g,蒸餾水100 mL,pH(7.0±0.2),121 ℃滅菌20 min;基礎發酵培養基[14-15]玉米粉4 g,麩皮2.5 g,豆粕3 g,KH2PO40.03 g,Na2HPO4·12H2O 0.4 g,蒸餾水100 mL,pH(7.0±0.2),121 ℃滅菌20 min;樟樹籽仁(含油量57.96%)、玉米粉、麩皮、豆粕市售;Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Na2CO3、NaCl、葡萄糖、三氯乙酸、乙醚分析純,西隴化工有限公司;瓊脂、干酪素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉分析純,天津大茂化學試劑廠;福林酚分析純,上海荔達生物科技有限公司。

FA1604電子天平德國賽多利斯有限公司;XMT1-8112電熱恒溫水浴鍋、TQZ-312型臺式全溫振蕩器、全自動高壓滅菌鍋、SKP-02420型電熱恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司;超凈工作臺吳江市凈化設備總廠;HS-2F型pH儀上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠;TGL-16G高速離心機上海安亭科學儀器廠;WFZ765PC型紫外可見分光度計上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1發酵培養基優化

1.2.1.1酶液的制作取一環活化好的菌株接種到肉湯培養基中,37 ℃、220 r/min 搖床培養24 h制得種子液。以4%的接種量將種子液加入到基礎發酵培養基中,37 ℃、220 r/min搖瓶培養48 h后,8000 r/min離心10 min,上清液即為酶液。

1.2.1.2蛋白酶活力測定方法采用國家標準GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》中規定的福林酚法檢測樣品中的中性蛋白酶活力[16]。

1.2.1.3碳源和氮源種類對菌株產蛋白酶能力的影響將基礎發酵培養基中的碳源(玉米粉)分別替換為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、甘油、檸檬酸鈉;將基礎發酵培養基中的氮源(豆粕)分別替換為蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸鈉、硫酸銨,其他條件同1.2.1.1,以基礎發酵培養基為對照,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.1.4玉米粉、麩皮、豆粕含量對菌株產蛋白酶能力的影響將基礎發酵培養基中玉米粉的含量分別調整為3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%;麩皮含量分別調整為1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4.5%;豆粕的含量分別調整為2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.1.5金屬離子對菌株產蛋白酶能力的影響在基礎培養基中分別添加0.1%(w/w)的CaCl2、ZnCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4、Fe2(SO4)3、MnCl2,其他條件同1.2.1.1,以不添加任何金屬離子的基礎發酵培養基為對照,比較各組酶液中性蛋白酶活力。

1.2.2發酵條件優化

1.2.2.1培養基pH對菌株產蛋白酶能力的影響用HCl和NaOH分別將基礎發酵培養基pH調節至5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.2發酵溫度對菌株產蛋白酶能力的影響將搖床溫度分別調節為29、31、33、35、37、39、41 ℃,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.3接種量對菌株產蛋白酶能力的影響將接種量分別調整為1%、2%、3%、4%、5%、6%,其他條件同1.2.1.1,分別測定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.4發酵時間對菌株產蛋白酶能力和菌體濃度的影響在發酵過程中每隔2 h檢測發酵液的中性蛋白酶活力、菌體濃度。菌體濃度以稀釋10倍的發酵液OD600計算。

1.2.3發酵培養基配方的正交實驗優化以玉米粉、麩皮、豆粕和氯化鈣含量為影響因子,設計L9(34)正交實驗,以確定菌株發酵培養基的最佳配比,其他條件選取以上單因素實驗的最優結果。正交實驗因子與水平表列于表1中。

表1　培養條件正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test for medium

1.2.4解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油取干燥至恒重的樟樹籽仁與去離子水1∶4(w/w)加入到膠體磨中,濕法粉碎5 min,獲得水乳液。以10%(v/v)的加酶量,將解淀粉芽孢桿菌Z16所產酶液加入到水乳液中,45 ℃保溫4 h。將上述發酵液90 ℃保溫10 min滅活,5000 r/min離心分離20 min。搜集下層渣相,70 ℃烘干至恒重,稱重,并用索氏提取法測定其含油率。吸取上層油乳相,經冷凍解凍法破乳化后獲得樟樹籽仁油。采用國家標準(GB/T 5530-2005)《動植物油脂酸價測定方法》測定樟樹籽仁油的酸價[17]。以滅活的淀粉芽孢桿菌Z16所產酶液為空白對照,以枯草芽孢桿菌AS1.398所產酶液為陽性對照。

樟樹籽仁油得率計算方法:

式中,X為樟樹籽仁油得率;M1和M2分別為樟樹籽仁質量與殘渣質量;C1和C2分別為樟樹籽仁含油率和殘渣含油率。

1.2.5解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油工藝條件優化

1.2.5.1酶解時間對樟樹籽仁油得率的影響將1.2.4中的酶解時間分別調整為1、2、3、4、5、6 h,其他條件及操作步驟同1.2.4。每組做4個平行實驗,分別檢測各組樟樹籽仁油得率。

1.2.5.2加酶量對樟樹籽仁油得率的影響將1.2.4中的酶液添加量分別調整為5%、10%、15%、20%、25%,其他條件及操作同1.2.4。每組做4個平行實驗,分別檢測各組樟樹籽仁油得率。

1.2.6數據分析數據表示采用四次測試所獲的平均值±標準偏差。通過使用統計程序軟件(SPSS 19.0)方差分析法(ANOVA分析)與隨后的單獨樣品抽樣t檢測用來進行比較。如果p<0.05,則差異被認為是系統上顯著。

2　結果與討論

2.1解淀粉芽孢桿菌 Z16產酶條件優化

不同碳源和氮源對解淀粉芽孢桿菌Z16發酵產酶的影響結果如圖1所示,由圖1A可知,菌株產中性蛋白酶的最適碳源為玉米粉,當以蔗糖、淀粉等為碳源時菌株產酶能力較低。這是因為易于被微生物利用的碳源或氮源有助于細胞生長,難以被微生物直接利用的碳源或氮源則有助于產酶[13]。由圖1B可知,培養基中的有機氮源較無機氮源更有利于菌株產酶,難以被利用的有機氮源比易于被利用的有機氮源更有利于菌株產酶。其中,菌株產中性蛋白酶的最適氮源為豆粕。

圖1　碳源和氮源種類對解淀粉芽孢桿菌 Z16產中性蛋白酶能力的影響Fig.1　The effects of carbon resources and nitro resource on proteinase producing

玉米粉含量、麩皮含量和豆粕含量對解淀粉芽孢桿菌Z16產中性蛋白酶能力的影響如圖2所示。由圖2可知,玉米粉含量與豆粕含量對菌株產中性蛋白酶能力的影響較大,當玉米粉含量為4.0%～4.5%時,菌株產中性蛋白酶活力達到4600 U/mL以上;當豆粕含量為3.5%時,菌株產中性蛋白酶活力最高,為5822.2 U/mL。麩皮含量對菌株產中性蛋白酶能力的影響不大,當麩皮含量為3.0%時,菌株產中性蛋白酶活力最高,為5089.4 U/mL。這是因為玉米粉和豆粕分別是培養基中的主要碳源與主要氮源,兩者含量的變化,都會對培養基的C/N產生較大的影響,從而影響菌株的產中性蛋白酶能力。麩皮含量對培養基C/N的影響不大,因而對菌株產中性蛋白酶能力影響也不大。

圖2　豆粕、玉米粉、麩皮含量對解淀粉芽孢桿菌 Z16產中性蛋白酶能力的影響Fig.2　The effects of soybean meal,corn meal and wheat bran content on proteinase producing

金屬離子、培養基pH、發酵溫度和接種量對解淀粉芽孢桿菌Z16產中性蛋白酶能力的影響繪于圖3中。由圖3A可知,Ca2+、Mn2+有激活菌株產酶的作用,分別較空白組提高了17.7%和5.1%。因為Ca2+有促進菌體生長、增加中性蛋白酶的穩定性而減少中性蛋白酶自溶的作用[13],Mn2+是該中性蛋白酶中的活性中心。

由圖3B可知,當培養基的pH低于7或者超過7.5時,菌株的產中性蛋白酶能力顯著下降,培養基pH為7.5時菌株產酶能力最高,達5250.4 U/mL。因為培養基的pH會影響菌體的形態和代謝產物的合成途徑,從而影響菌體的產酶量。由圖3C可知,發酵溫度為37 ℃時,菌株產中性蛋白酶能力最高,為5593.4 U/mL。發酵溫度過低,不利于菌株生長;發酵溫度過高,菌株衰老加快、蛋白酶穩定性變差、蛋白酶自溶增加,酶活力迅速降低。由圖3D可知,接種量為2%時,菌株產酶能力最高,為5826.2 U/mL。通常情況下,接種量越大,延滯期越短,然而接種量過大使得培養基中的營養物質過快地被消耗,代謝廢物增多,抑制菌株產酶[13]。

圖3　金屬離子、培養基pH、發酵溫度、接種量 對解淀粉芽孢桿菌Z16產中性蛋白酶能力的影響Fig.3　The effects of meal icons,pH,temperature and inoculum size on protease producing

由圖4中的菌體濃度曲線可以看出,解淀粉芽孢桿菌Z16細胞生長的遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期分別為0～20,20～30,30～50和50 h之后。由圖4中的酶活力曲線可以看出,解淀粉芽孢桿菌Z16發酵時間達到12 h后,中性蛋白酶活力開始迅速增高,因為菌體細胞生長進入遲緩期的后期,菌體開始大量分泌胞外蛋白酶分解環境中的蛋白質,以獲得足夠的氨基酸,為細胞快速分裂做準備。發酵時間達到44 h,中性蛋白酶活力達到最大值,為4695.9 U/mL。發酵時間達到44 h后,中性蛋白酶活力開始降低,因為菌體細胞生長開始進入穩定期的后期,培養基中誘導菌株產蛋白酶的營養物基本被消耗,導致菌株產中性蛋白酶能力降低。發酵時間達到50 h后,中性蛋白酶活力開始快速降低,細胞生長進入衰亡期,菌體細胞死亡加速,影響中性蛋白酶活力的胞內物質釋放到培養基中,加速了中性蛋白酶的自溶,導致中性蛋白酶活力迅速降低。對比上述兩條曲線也可知,該菌株產胞外中性蛋白酶與細胞生長是同步進行的。

圖4　解淀粉芽孢桿菌Z16發酵曲線Fig.4　The fermentation curve of Bacillus amlollquefaciens Z16

由表2可知,各因素影響作用按大小排列為:A>D>C>B。對正交實驗結果方差分析可知,FA>FD>FC>FB,即培養基中玉米粉含量對解淀粉芽孢桿菌產酶量的影響最大,麩皮含量對解淀粉芽孢桿菌產酶量影響最小,但在α=0.05水平上都不顯著,這可能是由于各因素水平間距較小造成的。理論優化組合為A3B1C3D2,即玉米粉4.5%、麩皮2.5%、豆粕4.0%、CaCl20.2%。在該條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16的產中性蛋白酶活力為6984.3 U/mL,比產酶條件優化前提高了54.0%(產酶條件優化前為4536.5 U/mL)[9]。

2.2解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油及其工藝條件優化

由表3可知,在相同提取條件下(加酶量10%、酶解時間4 h),解淀粉芽孢桿菌Z16組的樟樹籽仁油得率為87.9%,顯著高于空白組(75.8%)、枯草芽孢桿菌AS1.398組(陽性對照組)(79.5%),說明解淀粉芽孢桿菌Z16所產酶液耐受中碳鏈脂肪酸的能力強、對樟樹籽仁蛋白有很好的水解作用。解淀粉芽孢桿菌Z16組所得樟樹籽仁油的酸價較空白組有所升高,但大幅低于枯草芽孢桿菌AS1.398組(陽性對照組),即相對于空白組,解淀粉芽孢桿菌Z16組所得樟樹籽仁油的酸價升高值只有0.3 mg KOH/g,枯草芽孢桿菌AS1.398組(陽性對照組)酸價升高值達16.0 mg KOH/g。可能是因為枯草芽孢桿菌AS1.398所產酶液中脂肪酶活力(實測2.9 U/mL)比解淀粉芽孢桿菌Z16所產酶液中脂肪酶活力(0.088U/mL)高很多[9],致使水酶法提取樟樹籽仁油過程中的樟樹籽仁油水解率大幅提高,進而大幅提高樟樹籽仁油的酸價,降低樟樹籽仁油的質量。

表2　正交實驗結果Table 2　Rang analysis of orthogonal test for medium

注：*ki為各因素i水平所在實驗組對應實驗結果的平均值;極差R為各因素ki最大值與最小值之差。

表3　不同菌株的水酶法提取樟樹籽仁油結果比較Table 3　Comparison on results of aqueous enzymatic extraction camphor tree seed kernel oil with different strains

注：同一行字母相同為無顯著差異,字母不同為顯著差異。

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由圖5A可知,延長酶解時間可提高樟樹籽仁油得率,但酶解4 h后,樟樹籽仁油得率幾乎不再增加。因此,確定4 h為最適酶解時間,此時樟樹籽仁油得率為87.9%。由圖5B可知,增加加酶量可提高樟樹籽仁油得率,但當加酶量超過20%時,樟樹籽仁油得率增加不明顯。因此,確定20%為最適加酶量,在該條件下樟樹籽仁油得率為91.1%。

圖5　解淀粉芽孢桿菌Z16所產酶液的酶解時間 和添加量對樟樹籽仁油得率的影響Fig.5　The effects of enzymolysis time and addition enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16 on extraction rate of camphor tree seed kernel oil

3　結論

解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發酵培養基為:玉米粉4.5%,麩皮2.5%,豆粕4%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,121 ℃滅菌20 min;解淀粉芽孢桿菌Z16的最佳發酵條件為:接種量2%,37 ℃、220 r/min,搖瓶培養44 h。在最佳產酶工藝條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16所產中性蛋白酶活力為6984.3 U/mL,比產酶條件優化前提高了54.0%。

將解淀粉芽孢桿菌Z16所產酶液應用于水酶法提取樟樹籽仁油,可顯著提高樟樹仁油得率,而所得樟樹籽仁油的酸價升高很小。解淀粉芽孢桿菌Z16的水酶法提取樟樹籽仁油的效果顯著優于國內常用的中性蛋白酶生產菌(AS1.398)的效果,非常適用于水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂。

解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油的最適酶解時間為4 h、最適加酶量為20%(v/v)。在最佳提取條件下,解淀粉芽孢桿菌Z16水酶法提取樟樹籽仁油的樟樹籽仁油得率為91.1%。

Culture optimizations and application forBacillusamyloliquefaciensZ16 to produce neutral protease

ZENG Cheng1,MA Mao-mao2,XIAO Yan-jun2,3,*,ZENG Zhe-ling3,4,YU Ping4,ZHONG Wei-min5

(1.School of Medicine,The First Medical College,Nanchang University,Nanchang 330031,China;2.School of Life Science,Nanchang University,Nanchang 330031,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;4.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China;5. Fuzhou Vocational Technical College,Fuzhou 344106,China)

The enzyme-producing conditions ofBacillusamyloliquefaciensZ16 and the technological conditions of aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil were optimized by using single-factor experiment and orthogonal experiment,meanwhile,compared with theBacillussubtilisAS1.398. The best fermentation medium composition ofBacillusamyloliquefaciensZ16 was corn meal 4.5%,wheat bran 2.5%,soya bean meal 4.0%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,and the best fermentation conditions ofBacillusamyloliquefaciensZ16 were inoculation amount 2%,temperature 37 ℃,rate 220 r/min,shake flask culture 44 h. Under the best enzyme-producing technological conditions,the activity of neutral protease produced byBacillusamyloliquefaciensZ16 was 6984.3 U/mL,which was raised by 54.0% after the optimization. The optimum conditions of ofBacillusamyloliquefaciensZ16 aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil were enzyme adding proportion 20%(v/v),enzymolysis time 4 h. The corresponding camphor tree seed kernel oil yield was 91.1%,and its acid value only rose by 0.3 mg KOH/mL. The effect ofBacillusamyloliquefaciensZ16 on aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil was obviously superior toBacillussubtilisAS1.398 commonly used to produce neutral protease.

Bacillusamyloliquefaciens;neutral proteinase;camphor tree seed kernel oil;aqueous enzymatic extraction

2015-04-23

曾誠(1993-),男,本科,研究方向：應用微生物學,E-mail:18607080355@163.com。

肖彥駿(1990-),男,碩士,研究方向:應用微生物學,E-mail:thinkreed@126.com。

國家國際科技合作專項項目(2011DFA32770);江西省國際科技合作項目(20112BDH80004,20123BDH80011);南昌市對外科技合作項目(211-DWHZ-SWYY-001);江西省科技支持計劃重大項目(20143ACG70015);江西省高等學校科技落地計劃項目(KJLD12012);江西省教育廳產學研合作項目(GJJ11003);江西省科技支撐計劃項目(GJJ11003)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)03-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.033