板栗殼鞣質提取及其對DPPH自由基清除活性的研究

鄭佳欣,李怡婧,汪晨陽,章嘉男,史玲玲,王建中

(北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083)

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板栗殼鞣質提取及其對DPPH自由基清除活性的研究

鄭佳欣,李怡婧,汪晨陽,章嘉男,史玲玲*,王建中*

(北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083)

本研究以板栗加工的廢棄物板栗殼為原材料,以期得到板栗殼中鞣質的最佳提取工藝,并對其抗氧化活性進行考察。通過分析比較篩選出了板栗殼鞣質提取最佳溶劑為乙醇,較優提取方法為回流法,并在此基礎上實施了乙醇濃度、料液比和提取時間三個單因素實驗和以此為依據的正交實驗。結果表明,回流法提取板栗殼鞣質的最佳工藝條件為:25%乙醇為提取溶劑,提取時間為2 h,料液比為1∶10.5(g∶mL),在該條件下,板栗殼鞣質的提取量為14.617 mg/g;DPPH實驗結果表明板栗殼鞣質粗提物具有較強的清除DPPH自由基的能力,可以作為一種天然抗氧化劑予以開發。

板栗殼,鞣質,回流法,正交實驗法,抗氧化活性

板栗(castaneamollissimaBlume)為殼斗科(Fagaccac)栗屬(Castanea)喬木經濟植物,俗稱栗子,有“干果之王”的美稱[1],我國年產板栗果實約165萬t[2]。市場上多有以板栗果實為原材料開發的食品,板栗殼則被作為燃料或直接丟棄[3]。文獻報道:板栗殼中含有酚類、有機酸、多糖、內酯、香豆素、鞣質、甾體和黃酮等有效成分[4],因此,板栗殼作為廢棄物處理將導致板栗殼中大量的生物活性物質被浪費。

多酚是板栗殼的重要有效活性成分,具有較高的抗氧化能力[5-6],其包括低分子量的酚類成分和由這些低分子量成分經過聚合形成的高分子多酚——即鞣質類。近年來,鞣質類化合物作為一類新的活性物質,其研究日益受到人們的重視。約有70%以上的中草藥中含有鞣質類化合物[7],研究報道鞣質類物質具有抑菌[8]、抗腫瘤[9]、抗脂質過氧化[10]等功效,對心臟和心血管也有一定效應[11-12]。目前雖然板栗殼中多酚類物質的提取研究有所報道[13-14],但板栗中鞣質提取的研究僅限于板栗栗苞、栗葉[15],板栗殼中鞣質的提取研究未見報道。本文采用正交實驗法優化廢棄物——板栗殼中總鞣質的提取工藝,并對其清除DPPH自由基的能力進行考察,旨在為板栗殼資源的充分利用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

板栗殼采自河北遷西;沒食子酸對照品純度≥99.0%,中國藥品生物制品檢定所;干酪素純度:99.8%,北京奧博星生物技術有限責任公司;Ciocalteu’s phenol純度:99.8%,上海北諾生物科技有限公司;Na2CO3純度:99.95%,天津市光復科技發展有限公司;DPPH純度:>97.0%,Japan,TCI試劑公司;Trolox純度:97%,SIGMA-ALDRICH試劑公司;甲醇分析純,北京化工廠。

UV-2102C型紫外可見分光光度計尤尼柯儀器有限公司;FA2004A型電子分析天平上海精天電子儀器有限公司;SXKW型數顯電熱套北京中興偉業儀器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1總鞣質的測定

1.2.1.1對照品及樣品溶液的配制精密稱取沒食子酸對照品25 mg,置于50 mL棕色容量瓶中,用蒸餾水溶解,定容,搖勻即得對照品溶液。

精密稱取樣品干物質(提取得到的浸膏經凍干得到干物質)20 mg,置200 mL容量瓶中,用蒸餾水溶解,定容,即得0.1 mg/mL的樣品溶液。

1.2.1.2線性關系的考察精密吸取沒食子酸對照品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置于25 mL棕色容量瓶中,分別加Ciocalteu’s phenol試液1.0 mL,依次精密加蒸餾水13 mL,用濃度為29%的Na2CO3溶液定容至刻度,搖勻,室溫避光放置30 min。以蒸餾水作為空白,分別測定其在760 nm處的吸光度(A),以A為縱坐標,以質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,其線性回歸方程為y=87.445x+0.0584(R2=0.9940),沒食子酸在0.2～12.8 mg/L與A呈良好的線性關系。

1.2.1.3鞣質含量測定參考文獻[16],總酚含量的計算:量取樣品溶液3.0 mL,置于25 mL棕色容量瓶中,按方法1.2.1.2測定吸光度(A),根據標準曲線計算其質量濃度;

不被吸附的多酚含量:預先稱取0.1 g干酪素置于100 mL具塞錐形瓶中,精密量取樣品溶液25 mL至上述錐形瓶中,用塞密封,將錐形瓶置于30 ℃水浴中保溫1 h,期間不斷振蕩,取出后放至室溫,搖勻,過濾,倒掉初濾液,采集續濾液,量取2.0 mL續濾液置于25 mL棕色容量瓶中,按方法1.2.1.2測定吸光度(A),根據標準曲線計算其質量濃度。

鞣質含量測定公式如下:

鞣質含量=總酚含量-不被吸附的多酚含量

1.2.2板栗殼鞣質提取方法和提取溶劑的篩選實驗影響板栗殼鞣質提取的因素主要有提取方法、提取溶劑、提取時間和料液比等。為了篩選最佳提取方法和提取溶劑,本文分別采用了超聲提取法、冷浸提取法、回流提取法三種提取方法和純乙醇、甲醇、丙酮三種提取溶劑進行了篩選實驗。

1.2.2.1提取方法的篩選實驗精密稱取干燥板栗殼粉末30 g,以甲醇作為提取溶劑(200 mL),分別采用回流法(1 h)、超聲法(50 ℃,0.5 h)及冷浸法(室溫,24 h)進行提取,過濾后用旋轉蒸發儀蒸干得到浸膏,經凍干得到干物質,按方法1.2.1.3測定鞣質含量。

1.2.2.2提取溶劑的篩選實驗精密稱取干燥板栗殼粉末30 g,置于500 mL圓底燒瓶中,分別加入甲醇、乙醇、丙酮200 mL進行回流提取1 h,其余步驟同1.2.2.1,按方法1.2.1.3測定鞣質含量。

1.2.3板栗殼鞣質回流法提取的單因素實驗精密稱取30 g板栗殼粉末,用75%的乙醇溶液、料液比1∶9(g∶mL)、回流提取1.5 h。當研究某一因素時,其他條件保持不變。得到的提取物質,按照標準曲線處理方法,測定其在波長760 nm處的吸光度,見方法1.2.1.3,以比較提取的效果。

按方法1.2.1.3,以板栗殼鞣質提取量為考察指標,采用回流法,通過單因素實驗分別考察提取溶劑(乙醇濃度分別為0,25%,50%,75%,100%)、回流提取時間(0.5,1,1.5,2,3 h)和料液比(g∶mL)(1∶6,1∶7.5,1∶9,1∶10.5,1∶12)對板栗殼鞣質提取的影響,初步確定這幾個因素的相應水平范圍。

1.2.4板栗殼鞣質回流法提取的正交實驗設計板栗殼鞣質的提取過程受多個因素的影響,為了得到板栗殼鞣質的較科學的提取工藝,研究在上述1.2.3單因素實驗結果的基礎上,以乙醇和水的不同比例混合物作為提取溶劑,采用回流法,設計了以乙醇濃度、提取時間和料液比為考察對象的三因素三水平的正交實驗,因素水平見表1;正交設計實驗表為L9(34),對板栗殼鞣質的提取工藝進行優化。

表1　板栗殼中總鞣質提取工藝正交實驗因素水平Table 1　Orthogonal factors table of tannin extraction technology from Chestnut shell

1.2.5DPPH自由基清除測定體外評價物質抗氧化活性的方法有DPPH法、ABTS法、ORAC法、FRAP法等。與其他方法相比,DPPH法具有穩定性好、靈敏度高、操作簡單等優點[17-19]。故本文采用DPPH自由基清除法評價板栗殼鞣質的抗氧化活性。

板栗殼鞣質粗提物的準備:在上述1.2.4得出的提取優化工藝條件下,將提取得到的浸膏凍干,得到板栗殼鞣質粗提物。

自由基清除測定:以甲醇為溶劑,將板栗殼鞣質粗提物配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液。分別取0.1 mL樣品溶液,加入2.0 mL甲醇以及0.25 mL濃度為1 mmol/L的DPPH溶液。混勻后室溫避光放置30 min,以甲醇為空白,分別測定其在517 nm處的吸光度值;以Trolox(水溶性維生素E)作為陽性對照,計算板栗殼鞣質提取物對DPPH自由基的清除能力[20]。

DPPH自由基清除計算公式為:

式中:A對照:未加樣品溶液的DPPH自由基吸光度值;A樣品:加入樣品溶液反應后的DPPH自由基吸光度值。

1.3數據統計方法

實驗采用3組平行,所得數據取平均值,采用SPSS18 軟件進行方差分析。采用excel進行顯著性分析。

2　結果與分析

2.1板栗殼鞣質提取方法和提取溶劑的選擇

2.1.1提取方法的選擇如圖1可知,回流法(1h)對板栗殼鞣質提取效果最佳,不僅耗時短,而且鞣質提取量高;回流法、冷浸法和超聲法三種提取方法的鞣質提取量差異分別達到了顯著(p<0.05)水平。

圖1　不同提取方法對鞣質含量的影響Fig.1　Effect of different extraction method on the content of tannin注:字母不同表示差異顯著,p<0.05,圖2同。

近幾年來針對鞣質提取的研究也有不少,最為常用的方法有回流法[11]、超聲波輔助[21]、微沸法[22]、冷浸法[23]等。本文選用傳統的回流法(1 h)、超聲法(50 ℃,0.5 h)和冷浸法(室溫,24 h)三種提取方法進行篩選,最終確定了板栗殼鞣質的提取方法以回流法最佳。

2.1.2提取溶劑的選擇結果如圖2所示,乙醇的提取效果最佳,明顯優于甲醇和丙酮,三種溶劑的鞣質提取量差異均達到了極顯著水平(p<0.01)。其中丙酮的提取效果最差,甲醇提取的鞣質含量也顯著低于乙醇。

圖2　不同提取溶劑對鞣質含量的影響Fig.2　Effect of different extraction on the content of tannin

關于鞣質提取溶劑,有研究報道荔枝核中鞣質提取溶劑為丙酮時,提取效果最佳[24]。同時,也有研究報道沒食子中總鞣質提取溶劑效果最好的為甲醇[25]。而本研究中以丙酮作為提取溶劑時,板栗殼鞣質的提取量并不高,甲醇的提取效果也顯著低于乙醇,乙醇的提取效果最佳。根據化學結構,鞣質分為可水解鞣質、縮合鞣質和復合鞣質,其中復合鞣質是在板栗所屬——殼斗科植物中首次分離得到的;不同溶劑對板栗殼中鞣質提取的效果不同,是否與板栗殼中鞣質存在的結構形式有關還有待于進一步研究。此外,有機溶劑和水的復合體系在提取鞣質時使用更為普遍[26],所以本研究后續的鞣質提取溶劑采用乙醇及其與水的不同百分比的混合物。

2.2單因素實驗結果

2.2.1乙醇濃度對板栗殼鞣質提取量的影響由圖3可知,乙醇濃度對板栗殼鞣質的提取量影響比較顯著,當乙醇濃度為0～100%范圍內時,隨著乙醇濃度的增大,鞣質提取量逐漸增大而后又呈現出下降的趨勢,當乙醇濃度為50%時,鞣質提取量達最大值,為11.753 mg/g;當乙醇濃度繼續增大時,鞣質提取量呈現了顯著下降的趨勢。由于提取溶劑的極性、粘度隨著乙醇濃度的變化也發生變化,進而影響到板栗殼中鞣質的提取速度和溶出度。適當的乙醇濃度有利于鞣質的浸出,因此,乙醇濃度應選取50%左右為宜。

圖3　乙醇濃度對板栗殼鞣質提取量的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on the extraction amount of tannin from chestnut shell

2.2.2提取時間對板栗殼鞣質提取量的影響由圖4可知,回流提取時間在0.5～3 h之間時,隨著回流時間的增加,鞣質提取量呈現逐漸增大,經過一個平緩期繼而又減小的趨勢,回流時間為1.5 h時,鞣質的提取量最大,為13.649 mg/g;繼續延長回流時間,鞣質的提取量變化不大,有一個平穩期;當回流時間超過2 h,鞣質的提取量迅速下降,這可能是由于回流時間過長從而使多酚類結構遭到破壞,因此,板栗殼鞣質的回流提取時間應控制在1.5 h左右。

圖4　提取時間對板栗殼鞣質提取量的影響Fig.4　Effect of extraction time on the extraction amount of tannin from chestnut shell

2.2.3料液比對板栗殼鞣質提取量的影響由圖5可知,當提取過程中料液比在1∶6～1∶12(g∶mL)范圍內時,隨著料液比的增高鞣質提取量也隨之增大,當料液比為1∶10.5(g∶mL)時,鞣質提取量達最大值,為13.712 mg/g;之后繼續增加溶劑用量,鞣質的提取量變化不明顯。當板栗殼粉末的量一定時,提取溶劑的量越大,粉末與溶劑的接觸面內外濃度差越大,鞣質的提取速度和溶出度越大,越容易提取;當溶劑用量達一定值時,由于板栗殼中鞣質類物質含量逐漸降低,溶出度也越來越低,提取得率也趨于穩定。此外,從經濟角度考慮,溶劑用量也是越少越好。因此,板栗殼鞣質提取的料液比在1∶10.5(g∶mL)左右為宜。

圖5　料液比對板栗殼鞣質提取量的影響Fig.5　Effect of solid/liquid ratio on the extraction amount of tannin from chestnut shell

2.3板栗殼鞣質提取的正交實驗及結果分析

正交實驗設計及結果見表2,方差分析見表3。

根據表2中極差R值直觀分析可知,乙醇濃度、提取時間和料液比是影響板栗殼鞣質提取量的主要因素,其主次關系是B>A>C,即提取時間>乙醇濃度>料液比。乙醇濃度、提取時間和料液比對板栗殼鞣質提取量均具有極顯著影響。確定板栗殼鞣質的最佳提取工藝條件為A1B3C2,即板栗殼中添加10.5倍量25%乙醇溶液,回流提取2 h。

2.4最佳提取工藝驗證性實驗

為了驗證上述方法得到的最佳提取工藝條件是否合理可行,精密稱取板栗殼粉末3份,進行驗證性實驗,結果見表4。實驗結果表明在此工藝條件下板栗殼鞣質的平均提取量為14.617 mg/g(RSD=0.435%)。

表2　板栗殼鞣質提取正交實驗結果Table 2　Orthogonal experiment results of tannin extraction technology from Chestnut shell

表3　方差分析表Table 3　Variance analysis of orthogonal test

表4　最佳提取工藝驗證性實驗Table 4　Verification experiment of the optimum extraction process

2.5DPPH自由基清除能力實驗

由圖6可知,板栗殼鞣質粗提物和Trolox均具有較強的DPPH自由基清除能力,并且隨著溶液濃度的增加,其對DPPH自由基的清除能力越來越強。當溶液濃度為0.3 mg/mL時,板栗殼鞣質粗提物和Trolox對DPPH自由基的清除率均達到85%以上,表明板栗殼鞣質粗提物具有較強的抗氧化活性,可以作為一種天然的抗氧化劑進行開發。

圖6　板栗殼鞣質粗提物溶液 與Trolox溶液抗氧化能力的比較Fig.6　Comparison of antioxidant ability on tannin crude extracts from chestnut with Trolox注:字母不同表示同一樣品不同濃度間差異顯著, **表示不同樣品間差異極顯著(p<0.01), *表示顯著(0.01

3　結論

本文采用回流法從板栗殼中提取了鞣質類物質,通過單因素實驗和正交實驗法優化了其提取工藝,結果如下:提取溶劑為25%乙醇溶液,提取時間為2 h,料液比為1∶10.5(g:mL),這3個因素對板栗殼鞣質提取量的影響程度由大到小依次為提取時間>乙醇濃度>料液比。在此優化工藝條件下,鞣質提取量可達14.617 mg/g;進一步對板栗殼鞣質粗提物進行了抗氧化活性的考察,結果表明當板栗殼鞣質粗提物濃度為0.3 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除率達85%以上。研究結果表明,板栗殼中鞣質含量較高,并且在優化工藝條件下提取的鞣質粗提物具有較高的DPPH自由基抗氧化活性。

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Study on tannins extraction process from Chestnut shell and scavenging effects of DPPH free radical

ZHENG Jia-xin,LI Yi-jing,WANG Chen-yang,ZHANG Jia-nan,SHI Ling-ling*,WANG Jian-zhong*

(College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

The aim of the study was to obtain the optimum extraction method of tannins and study its scavenging effects of DPPH free radical from chestnut shell,which is a kind of waste in chestnut production. It was determined that the optimum extraction method was refluxing method and the optimum extraction solvent was ethanol by screening experiments. On the basis,single factor experiments and orthogonal experiments were carried out. The effects of different volume fractions of ethanol,extraction time and solid-liquid ratio were explored. And the optimum extraction conditions were that 25% aqueous ethanol solution as the best extraction solvent,the solid/liquid ratio of 1 to 10.5 and extraction time 2 h. Under these conditions,the extraction ratio for the chestnut shell tannin reached 14.617 mg/g. The antioxidant activity of tannin crude extracts was investigated by DPPH method,and the results showed that tannin crude extracts from chestnut shell had strong antioxidant effect and it could be explored as a kind of natural antioxidants.

chestnut shell;tannin;refluxing method;orthogonal experiment;DPPH

2015-06-05

鄭佳欣(1994-)，女，本科，研究方向：食品科學與工程，E-mail：zhengjx2016@163.com。

史玲玲(1981-)，女，在讀博士，中級實驗師，研究方向：植物資源加工與利用，E-mail：linglingshi2005@163.com。

王建中(1951-)，男，碩士，教授，研究方向：植物資源加工與利用，E-mail：w62338221@163.com。

國家林業公益性行業科研專項(201204401)北京市級項目：北京林業大學“北京市大學生科學研究與創業行動計劃”項目(S201410022042) 。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.036