外源過氧化氫酶對液態發酵紅茶色素的影響

鐘艷梅,鄭清梅,曾憲錄,鄧妙玲

(嘉應學院,廣東梅州 514015)

?

外源過氧化氫酶對液態發酵紅茶色素的影響

鐘艷梅,鄭清梅,曾憲錄,鄧妙玲

(嘉應學院,廣東梅州 514015)

為得到優質速溶紅茶,本研究以低檔綠茶為原料,對其水提液添加外源過氧化氫酶(CAT)進行液態發酵酶促轉化成紅茶茶湯,探討液態發酵工藝對紅茶色素生成量的影響,結果表明:參照優質紅茶色素含量標準,CAT酶促轉化的最優條件為:加酶量0.25 U/mL,反應溫度45 ℃,反應時間2 h,pH6。CAT與多酚氧化酶(PPO)存在雙酶協同作用,綠茶水提液先用PPO處理后(酶添加量 0.05 U/mL,溫度40 ℃,pH5,時間1.5 h)再用CAT處理,合成紅茶色素的效果比單一酶源好。

速溶紅茶,過氧化氫酶,多酚氧化酶,液態發酵

多酚氧化酶(PolypHenol oxidase,PPO)和過氧化物酶(Hydrogen Peroxidase,POD)是自然界中廣泛存在的兩種氧化還原酶類,更是茶中重要酶類,在茶樹生理代謝或茶葉加工中對多酚類物質的氧化變化、茶葉品質的形成起著決定性的作用。現代制茶發酵理論認為,紅茶發酵的實質就是其中的酚類在PPO及POD這兩種主要酶的作用下,發生一系列的酶促氧化聚合、縮合以及一些由于濕熱作用而引起的非酶促氧化反應,從而生成紅茶特有的色、香、味[1]。

速溶紅茶因保持了茶葉原來的色、香、味,且同時具備營養、衛生、方便等特點而深受消費者喜愛,已成為全球最受歡迎的飲品[2]。目前速溶紅茶多用成品紅茶作原料,也有用綠茶或其它茶作原料的,但需將茶提取液添加外源酶進行液態發酵酶促轉化,如日本利用低檔綠茶或陳綠茶加入外源PPO進行發酵處理,可使綠茶轉變為紅茶[3]。嚴鴻德[4]報道指出:鮮葉制成綠茶后,用沸水浸提得抽提液,加入茶樹新梢第二輪中提出的PPO,可制得速溶紅茶,成品有較好的香氣、滋味。POD在茶中的作用類似PPO,這種酶可從茶鮮葉中提取,與茶黃烷醇接觸后仍能保持它的活性[5]。有報道指出[6],茶葉內源POD可促進綠茶的轉化,用于綠茶直接制造速溶紅茶。添加H2O2在“發酵”過程中起氧化劑的作用,而茶葉POD則對茶黃烷醇的氧化起主要的催化作用[7]。葉慶余[8]則通過實驗證明在紅茶發酵過程中,PPO和 POD能催化兒茶素迅速氧化聚合成茶黃素(TFs)、茶紅素(TRs)和高聚類物質(如茶褐素TBs)。PPO催化能促使生成茶黃素和相對簡單的二聚體物質,而POD的催化底物較PPO廣泛,可催化茶黃素氧化形成不溶性的茶紅素復合物。由此認為,發酵后期茶黃素形成速度低于分解速度,而茶紅素及更高聚的不溶物質積累增快,可能與POD作用有關[9-10]。

有關研究表明,茶黃素是湯色“亮”的重要成分,茶紅素是湯色“紅”和滋味強度的主要物質,并與茶湯的濃度有關;茶褐素是湯色“暗”的主要原因。當茶褐素含量達6%～8%時,湯色呈現紅褐明亮的品質特征,而茶褐素含量低于5%時,湯色則呈現紅橙明亮的特征,這在工藝上被認為發酵不足。只有在茶紅素與茶黃素含量都較高且比例適當時,才能形成紅茶優良的品質[11-12]。

本研究以梅州當地的低檔綠茶為原料,添加POD中的過氧化氫酶(CAT)進行酶促液態發酵,將低檔綠茶加工為速溶紅茶,同時研究了CAT與PPO的雙酶協同作用,為茶葉深加工提供一定理論基礎和技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

低檔綠茶梅州清涼山綠茶加工過程中的茶葉碎,含部分茶梗。

T6可見分光光度計上海滬粵明科學儀器有限公司;FB224電子分析天平上海舜宇恒平科學儀器有限公司;HH.SY11-N14數顯恒溫水浴鍋常州華冠儀器廠;L420臺式低速離心機濟南博華儀器設備有限公司;過氧化氫酶(CAT、50000 U/g)廣東盛生物科技有限公司;多酚氧化酶(PPO、100000 U/g、含量60%)河南萬達食品添加劑。

1.2液態發酵紅茶湯制備

1.2.1綠茶水提液制備將低檔綠茶粉碎過40目篩,茶水比1∶20(g/mL),超聲波輔助浸提20～30 min,浸提溫度60 ℃,冷卻后以3500 r/min 離心15 min得到綠茶水提液,用于液態酶促發酵。

1.2.2液態酶促轉化

1.2.2.1單因素實驗酶轉化溫度：將綠茶水提液按0.15 U/mL的量添加外源CAT,設置不同溫度分別為15、25、35、45、55和65 ℃,在pH6條件下發酵2 h,轉化完成后將紅茶湯迅速冷卻至室溫并抽濾,進行茶黃素、茶紅素和茶褐素測定,以紅茶色素含量為指標篩選最佳轉化溫度。

酶轉化pH：酶源添加量同上,將綠茶水提液在35 ℃下發酵2 h,用檸檬酸-磷酸氫二鈉調節pH分別為3、4、5、6、7、8,所得茶湯同上處理,選出最佳轉化pH。

酶添加量：將綠茶水提液分別按0.03、0.09、0.15、0.3、0.45、0.6 U/mL的量添加外源CAT酶,在35 ℃、pH7條件下發酵2 h,所得茶湯同上處理,篩選最佳用酶量。

酶反應時間：將綠茶水提液按0.3 U/mL的量添加外源CAT,在35 ℃、pH7下發酵,設置不同反應時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 和3 h,所得茶湯同上處理,確定最佳反應時間。

1.2.2.2正交優化實驗在單因素實驗基礎上,選擇反應體系4個主要因素(溫度、pH、酶添加量、時間),采用L16(44)正交設計表進行4因素4水平的正交實驗,以確定CAT最佳反應條件,正交因素水平如表1。

表1　正交實驗設計Table 1　Orthogonal experimental design

1.2.2.3PPO和CAT雙酶轉化研究采用PPO、CAT雙酶源協同催化綠茶水提液,即先向反應體系中加入PPO(先前實驗獲得的最佳反應條件為:酶添加量0.05 U/mL,溫度40 ℃,pH5,時間1.5 h),然后用CAT處理,最后沸水浴30 s終止反應,檢測紅茶色素含量。

1.3分析方法

茶黃素、茶紅素、茶褐素檢測方法,采用比色系統分析法[13]。

1.4數據處理

所有的數據采用Excel2003和SPSS17軟件進行分析,采用Duncan(p<0.05)法進行多重比較,同一紅茶色素之間沒有共同字母的表示有顯著差異。

2　結果與分析

2.1酶促轉化單因素實驗結果

2.1.1最佳反應溫度對綠茶水提液添加CAT進行液態酶促發酵,考察不同反應溫度對紅茶色素生成的影響,實驗結果如圖1。

圖1　不同溫度對紅茶色素形成的影響Fig.1　The effect of different temperature on the synthetic tea pigment by using CAT

由圖1可知,CAT活力受溫度影響,不同溫度下,CAT催化形成紅茶色素的情況:35 ℃時與紅茶品質正相關的茶黃素含量(1.23%)和茶紅素含量(7.08%)顯著高于其它溫度,而與紅茶品質呈負相關茶褐素含量(7.85%)顯著低于其它溫度,參考優質紅茶中紅茶色素含量及比例(茶黃素一般為0.3%～1.5%、茶紅素一般為5%～11%、茶褐素一般為4%～9%,茶黃素與茶紅素之比1∶10～12)[13-14],此時各紅茶色素含量雖然符合要求,但茶黃素與茶紅素之比約為1∶6,不符合標準,而45 ℃時茶黃素含量(0.72%)、茶紅素含量(6.45%)及其比例(約為1∶9)以及茶褐素含量(7.59%)都比較符合標準,綜合考慮取35～45 ℃為較佳反應溫度范圍。

2.1.2最佳反應pH不同反應pH對速溶紅茶色素生成的影響,結果如圖2。

圖2　pH對紅茶色素形成的影響Fig.2　The effect of pH value on the synthetic tea pigment by using CAT

pH對兒茶素氧化產物形成的影響,首先是通過酶活力的作用,酶活力受環境pH的影響極大,過高或過低的pH會改變酶的性質,降低酶活力,從而使紅茶色素的形成量減少[15],由圖2可知不同pH條件下,CAT催化形成紅茶色素的情況。從實驗結果來看,當pH為7時,茶黃素生成量(0.89%)和茶紅素生成量(11.45%)均顯著高于其它pH的,茶黃素與茶紅素比為1∶12.9,此時茶褐素生成量為7.19%,各紅茶色素比較符合優質紅茶標準。而當pH為6時,雖然三種紅茶色素分別符合優質紅茶標準,但茶黃素與茶紅素比約為1∶18,茶紅素比例太高會使茶湯深暗,對紅茶品質不利,故最佳反應pH選擇7。

2.1.3最佳酶添加量不同酶添加量對速溶紅茶色素生成的影響,結果如圖3。

圖3　酶添加量對紅茶色素合成的影響Fig.3　The effect of enzyme concentration on the synthetic tea pigment by using CAT

由圖3可知,不同酶添加量條件下,CAT催化形成紅茶色素的情況:茶黃素生成量較高的酶添加量是0.3 U/mL(0.63%),顯著高于其它酶添加量;茶紅素生成量較高的酶添加量是0.3 U/mL(8.02%),此時兩者比例約為1∶12;在此酶添加量下,茶褐素生成量為8.81%,符合優質紅茶標準,故最佳酶添加量選0.3 U/mL。

2.1.4最佳反應時間不同反應時間對速溶紅茶色素生成的影響,結果如圖4。

圖4　反應時間對紅茶色素合成的影響Fig.4　The effect of reaction time on the synthetic tea pigment by using CAT

由圖4可知,不同反應時間下各色素含量變化:當反應時間為2.5 h時,茶黃素生成量(0.85%)和茶紅素生成量(6.33%)顯著高于其它反應時間(兩者比例1∶7.4)此時茶褐素生成量為8.79%,相比其它組比較符合優質紅茶色素含量標準,故最佳反應時間取2.5 h。

2.2反應條件的正交優化

表2、表4、表6分別為茶黃素、茶紅素和茶褐素正交實驗結果,表3、表5、表7為正交實驗的方差分析表。

表2　茶黃素正交實驗結果Table 2　The result of orthogonal experiment of TFs

CAT催化轉化茶黃素時,根據表2極差分析結果,各因素對茶黃素含量的影響順序為B>D>C>A;根據表3正交實驗方差分析結果,B因子具有顯著性(p<0.05)其他因素對實驗結果的影響不明顯;最優組合為A2B2C1D4。

表3　茶黃素正交實驗的方差分析表Table 3　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TFs

CAT催化轉化茶紅素時,根據表4極差分析結果,各因素對茶紅素含量的影響順序為D>B>C>A;根據表5正交實驗方差分析結果,D因子具有顯著性(p<0.05);最優組合為A4B3C4D1。

表4　茶紅素正交實驗結果Table 4　The result of orthogonal experiment of TRs

CAT催化轉化茶褐素時,據表6極差分析結果,各因素對茶褐素含量的影響順序為D>B>C>A;據表7正交實驗方差分析結果,各因子顯著性都不高;優組合為A3B2C2D2。

表5　茶紅素正交實驗的方差分析表Table 5　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TRs

表6　茶褐素正交實驗結果Table 6　The result of orthogonal experiment of TBs

表7　茶褐素正交實驗的方差分析表Table 7　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TBs

正交實驗后的茶黃素、茶紅素、茶褐素含量實驗結果經過方差分析,單獨分析出的優化條件不一致,則根據因素的影響主次等綜合考慮,確定最佳工藝條件。

對于因素A(反應時間),其對茶黃素、茶紅素和茶褐素影響均為次要因素,比較之下A1的紅茶品質較好,因此取A1(2 h);因素B(pH)對茶黃素影響排第一位,故取B2,其對茶紅素影響排第二位,取B3,而對茶褐素影響也排第二位,取B2,因此因素B取B2(6);因素C對茶紅素、茶黃素和茶褐素的影響都排第三位,分別取C1C4C2,三者相比取C4紅茶品質較好,故因素C取C4(45 ℃);對于因素D,其對茶紅素的影響排第一位,此時取D1,其對茶黃素和茶褐素的影響排第二位,為較次要因素,故因素D取D1(0.25 U/mL)。綜合分析,最優組合為A1B2C4D1,即加酶量為0.25 U/mL,反應溫度為45 ℃,pH6,反應時間2 h。

2.3雙酶催化轉化結果

結果如表8。

表8　單一酶源與雙酶源對合成紅茶色素的比較Table 8　The comparison between single enzyme and double enzyme on synthetic tea pigment

酶促氧化制備紅茶所采用的酶類主要是PPO和POD[16],其中PPO主要催化兒茶素生成茶黃素及相對簡單的二聚體,而POD不僅催化兒茶素生成茶黃素和二聚體,且能催化茶黃素生成茶紅素以及更復雜的高聚體TBs等,因此,在雙酶體系下酶促氧化可以進行得更徹底。由表8可知,單一酶源酶促轉化時,茶黃素和茶紅素的比例過小或過大;雙酶酶促轉化紅茶色素結果顯示:茶黃素含量略微超出標準,但茶黃素與茶紅素的比例適當,而茶褐素的生成量減少,使紅茶茶湯有較好的品質。

3　結論與討論

在紅茶液態發酵中,利用外源CAT可將綠茶水提液酶促轉化成紅茶茶湯,在一定條件下,其對紅茶色素的生成量有顯著影響,酶反應最優條件為:加酶量0.25 U/mL,反應溫度45 ℃,反應時間2 h,pH6。CAT與PPO存在雙酶協同作用,綠茶水提液先用PPO處理后(酶添加量0.05 U/mL,溫度40 ℃,pH5,時間1.5 h)再用CAT處理,生成紅茶色素的效果比單一酶源要好。

本實驗不但探究出外源CAT催化轉化紅茶色素的最佳條件,還首次采用雙酶作用于速溶紅茶液態發酵,與單一酶源轉化法相比,該方法可使茶黃素的生成量提高而使茶褐素的生成量減少,使得紅茶茶湯有較好的品質。先加入POD的作用主要是形成茶黃素,而酯型茶黃素(TFG和TFDG)中,TFG能被水解產生沒食子酸,且能導致苯丙卓酚酮環核的裂解作用而形成3,4-二羥苯甲酸、沒食子酸、咖啡酸和鄰苯二酚等一系列的裂解產物。Robertson研究認為[20],酯型茶黃素(TFG和TFDG)被水解產生沒食子酸的過程與CAT無關。隨后加入的CAT可使TFG酶促氧化轉化為茶紅素,因此在雙酶體系下該酶促反應可以進行得更為徹底。

[1]趙冰,李中皓,陳再根,等. 外源多酚氧化酶對普洱茶品質的影響研究[J]. 安徽農業科學,2012,40(30):40-43.

[2]Chung SH,Ryu D,Kim Ek，et al. Enzyme-assisted extraction of monimliform in form extruded comgrits[J]. Agric food chem,2005,53(13):5074-5078.

[3]方元超,趙晉府. 酶技術在茶飲料生產中的應用研究[J]. 中國食品添加劑,1999(1):12-15.

[4]嚴鴻德,汪東風,王澤民,等. 茶葉深加工技術[M]. 中國輕工業出版社,1997,60-62.

[5]方元超,趙晉府. 茶飲料生產技術[M]. 中國輕工業出版社,1961(5):205-207.

[6]張堂恒. 紅茶和速溶茶加工中酶的利用[J]. 茶葉,1988(2):5-7.

[7]余凌子,趙正惠. 酶制劑在茶葉加工中的應用[J]. 中國茶葉,1999(4):8-10.

[8]葉慶余. 紅茶萎凋發酵中多酚氧化酶、過氧化物酶同工酶的活性變化與兒茶素、茶黃素組分的消長[N]. 安徽農學院報,1986(2):19-29.

[9]宛曉春. 茶葉生物化學[M]. 第三版,中國農業出版社,北京,2003:41.

[10]劉仲華,黃建安. 紅茶制造中過氧化物酶變化的研究[N].湖南農學院學報,1990(2):15-18.

[11]趙和濤. 紅茶發酵時主要化學變化及不同發酵方法對工夫紅茶品質的影響[J]. 蠶桑茶葉通訊,1989(2):10-13.

[12]李輝. 紅茶發酵技術研究進展[J]. 蠶桑茶葉通訊,2001(2):21-23.

[13]陳啟坤. 紅茶色素的系統分析法[N]. 中國農學茶葉,1981(1).

[14]王洪新,孫軍濤,呂文平,等. 茶黃素的制備、分析、分離及功能活性研究進展[J]. 食品與生物技術學報，2011,30(1):18-21.

[15]蕭偉祥. 紅茶色素的形成與降解作用的初步研究[J]. 茶葉科學,1992,12(1):49-54.

[16]Dix,M A. et al. Fermeatation of tea in Aqueous of Tea Pcroxidase.[J]. Sci Food Agric,1981(32):923-932.

[17]張穎. 酶促氧化制備茶黃素及其性質研究[D]. 天津:天津科技大學,2010:1-7.

[18]方世輝,王先鋒,汪惜生. 不同發酵溫度和程度對工夫紅茶品質的影響[J]. 中國茶葉加工,2004(2):19-21.

[19]趙文霞,黃亞輝,吳春蘭,等. 發酵溫度和時間對潮州紅茶品質的影響[J]. 廣東茶葉,2013(21):25-27.

[20]Robertson,A. 理化因素對兒茶素體外氧化的影響. 國外農學-茶葉[M]. 李名君,譯. 1984(3):17-25.

Effect of exogenous catalase on the pigment composition of fermented instant black tea

ZHONG Yan-mei,ZHENG Qing-mei,ZENG Xian-lu,DENG Miao-ling

(School of Life Science,Jiaying University,Meizhou 514015,China)

Exogenous catalase was added in water extract solution of low-grade green tea to transform it into instant black tea by liquid state fermentation,the effects of enzyme types and addition rates on the pigment composition of black tea infusion were investigated;and fermentation technology was optimized by reference to standard of top quality black tea. Result showed that the optimized conditions were:catalase addition rate was 0.25 U/mL,fermentation temperature at 45 ℃,pH6,for 2 h. Pretreatment of the green tea extract with polyphenol oxidase(addition rate 0.05 U/mL,temperature 40 ℃,pH5,time 1.5 h)previous to the addition of catalase produced better pigment composition of black tea than addition of catalase along,indicating that synergetic action existed between the two enzymes.

instant tea;catalase;polyphenol oxidase;liquid-state fermentation

2015-04-23

鐘艷梅(1975-),女,碩士,講師,研究方向:食品資源研究開發,E-mail:zym@jyu.edu.cn。

鄭清梅(1979-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物化學,E-mail:zhqm78@163.com。

廣東省自然科學基金(S2013010013693)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.045