牦牛骨免疫活性肽的酶解制備研究

瞿　瑗,李　誠,程樂濤,夏春明,晏芳芳

(四川農業大學食品學院,四川雅安 625014)

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牦牛骨免疫活性肽的酶解制備研究

瞿瑗,李誠*,程樂濤,夏春明,晏芳芳

(四川農業大學食品學院,四川雅安 625014)

本文以脾淋巴細胞增殖率作為評價指標,比較了堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶對利用牦牛骨制備免疫活性肽的酶解效果。在單因素實驗的基礎上,采用正交實驗優化免疫活性肽酶解制備條件。結果表明,木瓜蛋白酶適合酶解牦牛骨制備免疫活性肽,其最佳酶解工藝參數為:酶解時間4 h,pH6.5,酶解溫度60 ℃,酶與底物比5000 U/g,底物質量濃度6 g/100 mL,對應的活性肽濃度為1.92 g/100 mL,此條件下脾淋巴細胞增殖率達72.09%。

牦牛骨,免疫活性肽,木瓜蛋白酶,酶解,脾淋巴細胞增殖

牦牛長期生活在高寒缺氧地帶,具有“高原之舟”之稱,全身營養價值頗高。其中占牦牛軀體總生物量三分之一的骨骼營養豐富,富含人體所需優質蛋白質、各種氨基酸、生理活性物質、維生素、礦物質,具有提高人體鈣質、減緩人體衰老、增強免疫力等功效[1-3],因此,牦牛骨具有極大的開發利用價值。目前,對畜禽骨的利用研究主要集中于魚骨、羊骨、豬骨等動物的副產物上,而對牦牛骨鮮有研究,因此,對其進行深入研究具有重要意義。

目前,免疫活性肽以其活性強、用量少、穩定性強、生物活性高的獨特優勢,而備受關注,其工業化生產已成為食品和醫藥行業的發展趨勢。近年來相關研究中,Hou等[4]從阿拉斯加鱈魚的骨架中分離出三種免疫活性肽,Asn-Gly-Met-Thr-Tyr、Asn-Gly-Leu-Ala-Pro 和Trp-Thr,其脾淋巴細胞增殖率分別為35.92%、32.96%和31.35%。免疫活性肽存在于許多食物中,而且這些食物在自然界里也較為豐富[5]。其中從骨骼這種相對便宜且可以利用的副產物里提取生物活性多肽,既可降低生產成本,又不失為一個有效的廢料處理方式[6]。因此,如何高效率的利用牦牛骨資源,從牦牛骨中提取具有免疫活性的多肽,不僅會為畜禽骨的深加工開拓新思路,還為人類對于免疫調節食品及藥物輔助劑的篩選提供了新選擇。

酶解法提取骨蛋白廣受國內外研究者的青睞,較其他提取骨蛋白的方法,酶解法具有防止環境污染、縮短提取時間等優勢。本文從四種蛋白酶中篩選出酶解效果最好的一種,采用正交實驗法優化酶解條件,獲得牦牛骨蛋白的免疫活性肽制備的最佳工藝,以期為牦牛骨資源的開發利用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牦牛骨粉牦牛骨經超微粉碎,粒度200目,四川省大渡河食品有限公司;昆明種小鼠體重25 g,6周齡,雄性,四川農業大學動物醫學院提供;堿性蛋白酶(2×105U/g)、胃蛋白酶(3×104U/g)、胰蛋白酶(2.5×105U/g)、木瓜蛋白酶(11×104U/g)源葉生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

BR4i型多功能冷凍離心機法國THERMO JOUAN公司;BT 12S電子天平上海越平科學儀器有限公司;311型CO2培養箱美國Thermo Scientific公司;QT-2旋窩混合器上海琪特分析儀器有限公司;iMark酶聯免疫檢測儀美國伯樂公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司;AS10200A超聲波清洗儀天津奧特賽恩斯儀器有限公司;PHS-3C酸度計上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1牦牛骨免疫活性肽的酶解制備工藝流程稱取一定量的牦牛骨粉→加入蒸餾水(100 mL)→混勻→預處理(90 ℃,10 min)→緩慢冷卻至常溫→調節pH到指定值→加入一定量的酶在指定溫度下酶解一定的時間→滅酶(100 ℃,10 min)→離心過濾(8000 g,20 min)。

1.2.2蛋白酶的選擇以酶解液脾淋巴細胞增殖率為評價指標,比較堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在各自的最適酶解條件下,按1.2.1中酶解工藝對牦牛骨蛋白進行酶解,篩選出適合用于酶法制備牦牛骨免疫活性肽的蛋白酶,各蛋白酶酶解條件見表1。

表1　各蛋白酶酶解條件[7-9]Table 1　Kinds of proteases enzyme conditions[7-9]

1.2.3單因素實驗根據1.2.2實驗結果,確定適合酶解的酶,再分別考察酶解時間、pH、酶解溫度、酶與底物比(E/S)、底物質量濃度五種影響因素對酶解液脾淋巴細胞增殖率的影響。

1.2.3.1酶解時間的影響控制底物質量濃度6 g/100 mL、pH6、酶解溫度60 ℃、酶與底物比6000 U/g,研究不同酶解時間2、3、4、5、6 h對酶解效果的影響。

1.2.3.2pH的影響控制底物質量濃度6 g/100 mL、酶解溫度60 ℃、酶與底物比6000 U/g、酶解時間4 h,研究不同pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0對酶解效果的影響。

1.2.3.3酶解溫度的影響控制底物質量濃度6 g/100 mL、pH6、酶底比6000 U/g、酶解時間4 h,研究不同酶解溫度50、55、60、65、70 ℃對酶解效果的影響。

1.2.3.4酶與底物比(E/S)的影響控制底物質量濃度6 g/100 mL、酶解溫度60 ℃、pH6、酶解時間4 h,研究不同酶與底物比4000、5000、6000、7000、8000 U/g對酶解效果的影響。

1.2.3.5底物質量濃度的影響控制pH6、酶與底物比6000 U/g、酶解時間4 h、酶解溫度60 ℃,研究不同底物質量濃度2、4、6、8、10 g/100 mL對酶解效果的影響。

1.2.4正交實驗根據單因素實驗結果,采用L9(34)正交實驗設計,以脾淋巴細胞增殖率為指標,選擇酶解時間、pH、酶解溫度、酶與底物比(E/S)進行工藝優化,其因素水平表見表2。

表2　正交實驗設計因素水平表Table 2　Levels and factors of orthogonal experimental design

1.2.5指標測定

1.2.5.1蛋白質采用凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)測定。

1.2.5.2酶活性采用福林酚法(SB/T 10317-1999)測定。

1.2.5.3肽含量的測定雙縮脲法[10]。

1.2.5.4脾淋巴細胞增殖率采用MTT法測定。小鼠禁食12 h后,放于超凈工作臺上,用75%的酒精擦拭腹腔,剖開腹腔,取出小鼠脾臟,去除外周結締組織,放于含有無菌Hanks液的平板中。用無菌注射器芯擠壓研磨,用Hanks液洗3次,離心10 min(1500 r/min),棄上清液。然后加入2 mL的RPMI 1640完全培養液制成5.0×106個/mL[11-12]細胞懸浮液。

設實驗組和對照組(均復設3孔)。將脾細胞懸液加入到96孔板中,100 μL/孔,空白組加入RPMI 1640細胞培養液,100 μL/孔,實驗組加入酶解液,100 μL/孔。置于37 ℃下5% CO2培養箱中培養68 h,然后加50 μL MTT培養4 h后,于1500 r/min離心10 min后,每孔吸取150 μL上清液棄去,再每孔加入150 μL酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結晶完全溶解。室溫下放置15 min后,用酶聯免疫檢測儀,以570 nm波長測定光密度值[13]。脾淋巴細胞增殖率按下式計算。

1.2.6數據分析方法利用Excel 提供的各種函數進行L9(34)正交實驗數據的處理,利用SPSS中的Duncan法進行多組樣本間差異顯著性分析。

2　結果與分析

2.1蛋白酶的確定

堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解牦牛骨蛋白后對酶解液脾淋巴細胞增殖率的影響見表3。

從表3中可以看出:牦牛骨酶解產物對脾淋巴細胞有增殖作用。其中,木瓜蛋白酶酶解牦牛骨的產物對脾淋巴細胞的增殖作用最大,增殖作用最小的是胰蛋白酶,增殖作用從大到小依次為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶,所以木瓜蛋白酶對牦牛骨蛋白酶解效果最好,因此,選擇木瓜蛋白酶為酶解牦牛骨蛋白制備免疫活性肽的適宜催化劑。

表3　4種蛋白酶對酶解效果的影響Table 3　The effect of four kinds of proteases on the enzymatic

注:表中不同小寫字母之間存在顯著性差異,p<0.05。

2.2單因素實驗結果與分析

2.2.1酶解時間對酶解效果的影響由圖1可知,酶解時間在2～4 h范圍內,隨著時間的增加,脾細胞增殖活性逐漸增強,時間為4 h時,脾淋巴細胞增殖率達到最高,超過4 h后增殖活性顯著降低。這主要是因為在酶解初期,底物質量濃度較高,酶活性較高,酶解較快;但是酶解pH在酸性環境下,隨著酶解時間的增加,底物逐漸被轉化而導致酶解速度下降,產生的具有免疫活性的多肽被繼續酶解成更小分子質量的小肽,使得脾細胞增殖活性顯著降低。因此,選擇酶解時間為3～5 h進行后續實驗。

圖1　酶解時間對酶解效果的影響Fig.1　Influence of time on the enzymatic hydrolysis注:圖中不同小寫字母之間存在顯著性差異, p<0.05;圖2～圖5同。

2.2.2pH對酶解效果的影響由圖2可知,pH在6.0之前,隨著pH的升高,脾淋巴細胞增殖活性顯著增強,在pH為6.0時,脾淋巴細胞增殖率達到最大;pH繼續增大,脾淋巴細胞增殖活性顯著降低。這是因為底物和酶的構象受pH的影響,進而影響酶與底物的結合,最終影響酶促催化效果。因此,選擇pH為5.5～6.5進行后續實驗。

圖2　pH對酶解效果的影響Fig.2　Influence of pH on the enzymatic hydrolysis

2.2.3酶解溫度對酶解效果的影響由圖3可知,隨著酶解溫度升高,脾淋巴細胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢,主要是因為在一定范圍內,隨著溫度升高,酶活力增強,反應速率加快;但太高的溫度會使酶變性失活,產物形成方向發生轉變。酶解產物的脾淋巴細胞活性在60 ℃時達到最大。因此,選擇酶解溫度為55～65 ℃進行后續實驗。

圖3　酶解溫度對酶解效果的影響Fig.3　Influence of temperature on the enzymatic hydrolysis

2.2.4酶與底物濃度比對酶解效果的影響由圖4可知,酶底比在4000～6000 U/g范圍,隨著酶底比的升高,脾淋巴細胞增殖率顯著升高,酶底比為6000 U/g時,脾淋巴細胞增殖率達最大值,而后脾淋巴細胞增殖率開始下降。這主要是因為在底物充足的情況下,提高酶量可促進底物與酶結合,從而加快反應速率;但酶量持續增加至酶分子基本飽和后,而底物不足,使得反應速率降低,并且酶會作用于具免疫活性的肽鏈,使其降解。因此,選擇酶底比為5000～7000 U/g進行后續實驗。

圖4　酶與底物濃度比對酶解效果的影響Fig.4　Influence of E/S on the enzymatic hydrolysis

2.2.5底物濃度對酶解效果的影響當底物濃度太高,酶的活性部位被底物分子占據,使得酶促反應速度趨于極限;底物濃度過低時,酶的活性部位與底物分子結合幾率減小,使得酶促反應速度減慢[14]。由圖5可知,底物濃度在6 g/100 mL之前,隨著底物濃度的增加,脾淋巴細胞增殖率顯著升高,在6 g/100 mL時脾淋巴細胞增殖率達到最高,而后脾淋巴細胞增殖率顯著降低,這可能是因為在底物質量濃度較低時,酶相對過量,隨著濃度增大,酶與底物結合的幾率提高,酶能充分發揮作用。由于底物濃度對酶解效果的影響較其它各因素的影響較小,所以木瓜蛋白酶酶解牦牛骨蛋白制備免疫活性肽的適宜底物質量濃度為6 g/100 mL。

圖5　底物濃度對酶解效果的影響Fig.5　Influence of substrate concentration on the enzymatic hydrolysis

2.3正交實驗

木瓜蛋白酶酶解牦牛骨蛋白制備免疫活性肽的正交優化實驗結果及分析見表4和表5所示。

表4　正交實驗結果Table 4　The results of orthogonal experiment

表5　脾淋巴細胞增殖率的方差分析表Table 5　Analysis of Variance on proliferation rates of spleen cell

通過極差分析和方差分析可知,在木瓜蛋白酶酶解牦牛骨蛋白制備免疫活性肽正交實驗中,酶解時間、pH、酶解溫度、酶與底物比(E/S)四個因素對脾淋巴細胞增殖活性作用的大小依次為:酶解時間>pH>酶解溫度>酶與底物比(E/S),其中酶解時間的影響極顯著(p<0.01),pH的影響顯著(p<0.05),最佳工藝參數為:酶解時間4 h,pH6.5,酶解溫度60 ℃,酶與底物比5000 U/g。此最優酶解條件下的活性肽濃度為1.92 g/100 mL。對優化后的參數進行3組驗證性實驗,酶解液脾淋巴細胞增殖率分別達到69.09%、73.62%、73.55%,平均值為72.09%,明顯高于正交實驗組合實驗值。因此,木瓜蛋白酶酶解牦牛骨制備免疫活性肽的工藝參數準確可靠,具有較高實用價值。

3　結論

在選用的四種蛋白酶中,木瓜蛋白酶酶解制得的肽段脾淋巴細胞增殖活性最強,故選擇其為酶解牦牛骨蛋白制備免疫活性肽的適宜催化劑;采用該酶酶解牦牛骨制備免疫活性肽的最佳工藝參數為:酶解時間4 h,pH6.5,酶解溫度60 ℃,酶與底物比5000 U/g,底物質量濃度6 g/100 mL,對應的活性肽濃度為1.92 g/100 mL,此時脾淋巴細胞增殖率為72.09%。馬儷珍[15]以鯰魚頭、骨為原料,分別用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對其酶解制備免疫活性肽,最終得出木瓜蛋白酶酶解制得的肽段脾淋巴細胞增殖活性最高,本研究與其結果一致。

本實驗研究結果為牦牛骨資源的開發利用提供依據。但是,實驗僅系統的研究了利用牦牛骨制備免疫活性肽的酶解條件,因此需要進一步探討其分離純化,以便其精細化利用。

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Study on yak bone immune active peptide preparation by enzymatic hydrolysis

QU Yuan,LI Cheng*,CHENG Le-tao,XIA Chun-ming,YAN Fang-fang

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The proliferation of hydrolysates on spleen lymphocyte was selected as an indicator. The effects of alkaline protease,pepsin,trypsin and papain on the hydrolysis of yak bone were compared. Based on single factor experiment,orthogonal experiment was used to optimize the enzymatic hydrolysis conditions for immune active peptide preparation. The result showed that papain was suitable for producing yak bone immune active peptide and the optimum enzymatic hydrolysis conditions were determined as follows:4 h of enzymatic hydrolysis time,6.5 of pH,60 ℃ of enzymatic hydrolysis temperature,5000 U/g of ratio of enzyme and substrate,6 g/100 mL of substrate concentration,and the corresponding active peptide concentration was 1.92 g/100 mL. Under such conditions,the proliferation rates of spleen lymphocyte was 72.09%.

yak bone;immune active peptide;papain;enzymatic hydrolysis;spleen lymphocyte

2015-06-03

瞿瑗(1993-)，女，本科，研究方向：食品質量與安全(食品檢測技術方向)，E-mail：112119120a@163.com。

李誠(1962-)，男，碩士，教授，研究方向：畜產品質量及安全控制，E-mail:lichenglcp@163.com。

四川省科技成果轉化項目“牦牛壯骨面產業化開發研究”(13CGZHZX0206)。

TS251.94

B

1002-0306(2016)03-0271-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.048