水產品中甲基汞測定方法的優化

劉　奇,柯常亮,陳潔文,林頌雄,蔡　楠,黃　珂,紀曉敏,李劉冬,*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(廣州),廣東廣州 510300;2.汕尾市海洋與漁業環境監測站,廣東汕尾 516611)

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水產品中甲基汞測定方法的優化

劉奇1,柯常亮1,陳潔文1,林頌雄1,蔡楠1,黃珂1,紀曉敏2,李劉冬1,*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(廣州),廣東廣州 510300;2.汕尾市海洋與漁業環境監測站,廣東汕尾 516611)

本研究對標準方法進行了優化,建立了水產品中甲基汞殘留的快速測定方法。本方法采用硫酸和溴化鉀超聲輔助提取樣品中甲基汞,經甲苯反萃,氣相色譜測定。結果顯示,在25.0～1000 μg/L濃度范圍內,甲基汞標準曲線方程為y=21.49x-660.9,線性良好(r=0.9995);方法檢測限和定量限分別為7.58、25.0 μg/kg;加標量為50.0、100、500、1000 μg/kg時,回收率范圍為80.8%～108%,相對標準偏差范圍為1.56%～8.10%,表明該方法滿足水產品中甲基汞殘留測定的要求。方法優化后步驟減半,耗時縮短三分之二,樣品分析效率大幅提高,適合批量測定水產品中甲基汞殘留。

甲基汞,水產品,氣相色譜法,快速測定

甲基汞是一種劇毒有機重金屬污染物,可對人體造成以神經系統為主的全身性傷害[1],并有致癌作用[2]。甲基汞污染引起的日本水俁病事件是世界八大公害事件之一[3]。水體和底泥中70%以上的汞以甲基汞的形式存在[4],由于分子量小、脂溶性強,甲基汞極易在水產品中富集,經食物鏈進入人體[5]。研究表明,水產品是人類甲基汞暴露的主要來源[6]。為保障人體健康,聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)規定,水產品中肉食魚類和非肉食魚類甲基汞限量分別為1.0、0.5 mg/kg,中國、美國等采納了該標準[7-8];2015年起,歐盟將水產品及水生生物中汞和汞類化合物環境質量標準(EQS)設為20 μg/kg[9],進一步加強對甲基汞的危害控制。近年來,我國加強了食品質量安全的監管,水產品中甲基汞殘留的監控覆蓋面和樣品數量大幅增加,對分析方法的要求也越來越高。

水產品中甲基汞殘留測定方法是近年來研究熱點。氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[10]、原子熒光法(AFS)[11-12]、電感耦合等離子體質譜法(ICPMS)[13-14]和氣相色譜法[15]等現代儀器分析技術被廣泛應用于甲基汞檢測研究。其中,GC-MS法靈敏度高,但需要四乙基硼化鈉(NaBEt4)等試劑進行衍生,操作復雜,且NaBEt4室溫下遇到含有機物的蒸汽就會燃燒爆炸,危險性高。AFS及ICPMS在定性和定量方面都具有較好的準確度和靈敏度,但需與色譜串聯,儀器復雜且價格昂貴。我國標準中水產品甲基汞殘留測定方法為氣相色譜法,該法具有靈敏度高、儀器價格低廉等優勢,在實際工作中被廣泛應用;但其前處理操作繁雜,對色譜柱及巰基棉柱要求高,結果不穩定[16],大批量樣品測定較難操作,需進一步優化改進。

本研究對甲基汞殘留檢測氣相色譜法樣品前處理過程進行改進,建立了水產品中甲基汞殘留量檢測新方法,方法簡便、準確、快速、環保且成本低,為水產品中甲基汞風險監測提供可靠的技術支持。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

氣相色譜儀(配μECD檢測器)7890A型,Agilent公司;色譜柱DB-5型(30 m×0.25 mm×0.25 μm),Agilent公司;電子天平XP205DR型,瑞士梅特勒公司;冷凍離心機DL-6000B型,上海安亭科學儀器廠。

氯化甲基汞標準物質(CAS 115-09-3)96.0%,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲苯色譜純,Sigma-Aldrich公司;五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)、溴化鉀、濃硫酸均為分析純。

硫酸銅溶液(1.0 mol/L):稱取62.5 g CuSO4·5H2O加純水溶解定容至250 mL;溴化鉀-硫酸混合溶液:稱取180 g溴化鉀溶于200 mL純水中,取55.0 mL濃硫酸溶于100 mL純水中,將兩份溶液混合定容至500 mL。

1.2儀器條件

參考朱霞萍等[17]方法。進樣口溫度250 ℃;進樣量1 μL,不分流進樣;恒流模式,柱流速2 mL/min;μECD檢測器溫度300 ℃,尾吹氣50 mL/min;初始柱溫60 ℃,保持1 min,以20 ℃/min升至130 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至280 ℃,保持1 min。

1.3標準溶液配制

1.3.1標準儲備溶液準確稱取氯化甲基汞標準物質0.0626 g,以甲苯溶解定容至50.00 mL容量瓶,配成質量濃度為1000 mg/L的甲基汞標準儲備溶液,2～5 ℃條件下可儲存1年。

三、總之，玉米粗縮病是具有毀滅性的病害，只要發生就會很難治理，雖然在病株上噴施藥劑但也難恢復正常生長。因此，加強在玉米粗縮病常發地區定點監測和預報，定期調查小麥、田間雜草和玉米粗縮病的病株率，同時也調查灰飛虱越冬基數、發生密度和帶毒率，及時清除田間雜草，改變種植模式使用種子包衣，在科學的引導下農民集中使用藥劑防治，將農業防治和化學防治相結合，才能有效控制灰飛虱和玉米粗縮病的發生，控制粗縮病的危害蔓延，盡可能的降低產量損失，提高玉米產量，增加農民收入。

1.3.2標準中間溶液準確移取甲基汞標準儲備溶液1.00 mL,以甲苯定容至100.0 mL容量瓶,配成質量濃度為10.0 mg/L的甲基汞標準中間溶液,2～5 ℃條件下可儲存6個月。

1.3.3標準使用溶液使用時,移取一定體積的甲基汞標準中間溶液,用甲苯配制成質量濃度分別為25.0、50.0、100、200、500、1000 μg/L的標準工作溶液。

1.4樣品前處理

新鮮魚、蝦、貝取可食肌肉組織搗碎、混勻,稱取2.00 g樣品于50 mL具塞離心管中,加入1.00 mol/L硫酸銅溶液0.5 mL、純水4.0 mL,渦旋混勻;向離心管中加溴化鉀-硫酸混合溶液2.0 mL,渦旋混勻;250 W超聲提取10 min;5500 r/min,4 ℃離心10 min,將上清液轉移至另一50 mL具塞離心管。再向樣品殘渣加入1.00 mol/L硫酸銅溶液0.5 mL、純水4.0 mL、溴化鉀-硫酸混合溶液2.0 mL,按以上步驟重復提取一次,合并兩次提取液。向提取液中加入4.0 mL甲苯,渦旋混合,靜置分層,吸取1.0 mL上層甲苯于進樣瓶中,用于氣相色譜儀分析。

2　結果與討論

2.1樣品前處理

甲基汞在生物組織中易與硫結合,必須破壞硫化合物并將其轉化為鹵代甲基汞,才可將甲基汞提取至有機溶劑中[18]。Hintelmann[19]研究表明,硫酸銅、硫酸和溴化鉀混合溶液對甲基汞的提取效果優于鹽酸、氫氧化鉀等提取液,且產生乙基汞等雜質較少。本研究利用Cu2+置換出組織中的甲基汞,通過溴化鉀-硫酸混合溶液將甲基汞轉化為溴化甲基汞,以達到對樣品中的甲基汞提取分離的目的。圖1為在本實驗條件下得到的濃度為50.0 μg/L甲基汞標準溶液(A)和加標量為100 μg/kg的牡蠣樣品(B)氣相色譜圖。從圖中可以看出,本方法對樣品處理后得到的甲基汞色譜峰峰型尖銳、對稱,信號響應高,基體干擾小。硫酸銅、硫酸和溴化鉀混合溶液對甲基汞的提取和純化達到了滿意效果。

圖1　甲基汞標準品(A)和牡蠣樣品(B)氣相色譜圖Fig.1　Gas chromatograms of MMC standard solution(A) and 100 Oyster tissue spiked with MMC(B)

表1　GB/T5009.17-2003和本方法甲基汞檢測前處理過程比較Table 1　Comparison of the preparation procedure for MMC determination using GB/T5009.17-2003 or primary method

注:表中所列耗時為作者處理一個實驗樣品所需時間,結果因操作不同可能存在差異。

本研究用毒性較小的甲苯代替苯作為萃取劑[20],降低了實驗對環境和操作人員健康造成的危害。同時,本研究在反萃過程中采用5500 r/min高速離心處理,避免乳化現象,有助于提高回收率。

此外,本研究采用超聲10 min輔助提取樣品中的甲基汞,各樣品回收率可達80%以上(表2);與振蕩提取60 min處理[16]相比,本方法不僅能提高提取速率,也能增大提取效率。

2.2方法效率評估

GB/T 5009.17-2003處理一個樣品至少需12步,經3次轉移和1次過柱與洗脫,共耗時約100 min(表1),其操作過程繁雜,尤其巰基棉富集過程容易導致結果重現性欠佳[16]。本研究前處理過程只需7步,經1次轉移過程,單個樣品耗時僅約30 min,前處理簡便、快速。本方法所有操作在離心管中完成,避免了多次轉移對目標物造成的損失,保證了回收率,也節約了實驗試劑和材料,降低成本。

此外,GB/T5009.17-2003法需在實驗前制備巰基棉,整個制備過程約需5 d,制備過程對溫度、水分要求較高,且巰基棉吸附效率對實驗結果影響較大。本研究實驗前只需簡單的溶液配制,操作簡單。

2.3線性關系

將標準工作溶液進氣相色譜測定,以峰面積為縱坐標y,以甲基汞的質量濃度為橫坐標x,作線性回歸分析并繪制標準曲線(圖2)。所得線性方程為y=21.49x-660.9,線性相關系數r=0.9995,甲基汞在25.0～1000 μg/L濃度范圍內有良好線性。

圖2　甲基汞標準工作曲線Fig.2　Calibration curve for MMC determination

2.4檢出限與定量限

本研究以甲基汞添加量為50.0 μg/kg的空白樣品考察方法靈敏度。加標樣品按上述方法進行提取、凈化、測定并計算信噪比。以3倍信噪比(S/N=3)時對應的添加濃度為檢出限,以10倍信噪比(S/N=10)對應的添加濃度為定量下限,依此計算得出,本方法檢出限為7.58 μg/kg,定量限為25.0 μg/kg,陳雪昌等[1]利用高效液相色譜-原子熒光法測定水產品中甲基汞定量限為20 μg/kg,靈敏度同本法相近。該法檢出限遠低于國內標準規定限量[7],結果靈敏可靠,可以滿足甲基汞檢測工作等需求。

2.5回收率與精密度

本研究以草魚、卵形鯧鲹、對蝦、牡蠣等4種代表性水產品進行加標實驗(表2),空白加標樣品中未檢出甲基汞。每種水產品分別做4個濃度水平,每個水平做6個重復,按上述方法測定樣品中的甲基汞含量,考察方法的回收率和精密度。結果顯示(表2),4種水產品在加標濃度為50.0、100、500、1000 μg/kg時,回收率范圍為80.8%～108%,相對標準偏差范圍為1.56%～8.10%。由此可見,本方法測定4種不同水產品基質中甲基汞都有較高的回收率和良好的精密度,可以滿足水產品中甲基汞殘留檢測要求。

表2　不同水產品加標回收率與精密度(n=6)Table 2　Recovery and precision for MMC determination in different aquatic product(n=6)

3　結論

本研究對甲基汞氣相色譜法前處理過程進行優化,改進后的方法甲基汞提取和凈化過程簡便、快速、環保、節約,檢測結果雜質干擾少,在25.0～1000 μg/L濃度范圍內線性良好,方法靈敏、可靠,回收率高,精密度和準確度都可以滿足實際工作中大量樣品檢測需求。

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Method optimization for methylmercury determination in aquatic products

LIU Qi1,KE Chang-liang1,CHEN Jie-wen1,LIN Song-xiong1,CAI Nan1,HUANG Ke1,JI Xiao-min2,LI Liu-dong1,*

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300,China;2. Shanwei Oceanic and Fishery Environment Monitoring Station,Shanwei 516611,China)

A method was developed for methylmercury(MMC)fast determination in aquatic products through standard method optimizing. Samples were extracted by sulfuric acid and potassium bromide in assist of ultrasound,back-extracted by toluene,detected by gas chromatography(GC). As shown,calibration curve(y=21.49x-660.9)was in good linearity with a correlation coefficient of 0.9995 in the range of 25.0～1000 μg/L. The limit of detection(LOD)and the limit of quantitation(LOQ)were 7.58 and 25.0 μg/kg,respectively. While spiked at 50.0,100,500 and 1000 μg/kg,the recoveries of MMC ranged from 80.8% to 108% with relative standard deviation(RSD)of 1.56%～8.10%. It indicated that the method was qualified to detect MMC residue in aquatic products. After optimization,efficiency of sample analysis was greatly improved because of the reduction of half procedures and two thirds time saving,which made the method suitable for quantitation of MMC in batch samples.

methylmercury;aquatic products;GC;fast determination

2015-04-13

劉奇(1987-),男,碩士研究生,研究實習員,研究方向：水產品質量安全,E-mail:liuqi03@hotmail.com。

李劉冬(1959-),男,本科，研究員,研究方向：水產品質量安全,E-mail:168LLd@163.com。

國家農產品質量安全風險評估重大專項(GJFP2014009)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(中國水產科學研究院南海水產研究所,2014TS10)；農業部水產品加工重點實驗室開放基金項目(NYJG201306)。

TS254.7

A

1002-0306(2016)03-0299-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.054