正交實驗法優化屈曲花總黃酮的超聲波輔助提取工藝

鄧思節,漢斯·格里格森

(重慶大學生物工程學院,生物流變科學與技術教育部重點實驗室,重慶 400044)

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正交實驗法優化屈曲花總黃酮的超聲波輔助提取工藝

鄧思節,漢斯·格里格森*

(重慶大學生物工程學院,生物流變科學與技術教育部重點實驗室,重慶 400044)

本文采用正交實驗設計法優化了超聲波輔助提取屈曲花總黃酮的工藝條件。首先,通過單因素實驗研究乙醇濃度、提取時間、料液比和超聲波功率對總黃酮得率的影響。然后,利用正交實驗設計法優化最佳提取工藝。實驗結果表明,乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響最大,其次依次為提取時間、料液比、超聲波功率。最佳的提取條件為乙醇濃度85%、料液比1∶70、提取時間15 min、超聲波功率100 W。在該條件下,總黃酮得率為2.456%。本文為工業化應用提供了參考標準,也為廣泛開發利用屈曲花藥物資源提供了良好的參考價值。

屈曲花,黃酮,超聲波輔助提取,正交實驗

屈曲花(Iberisamara)為十字花科屈曲花屬一年生草本植物[1-2],又名珍珠球、蜂室花等,原產于南歐,主要集中在地中海區域[1],目前已由人工引種栽培。研究表明,屈曲花鮮植株中富含多種活性成分[1,3-5],如有機胺類、芥子油甙類和黃酮類物質[2-3]。黃酮類物質屬于天然多酚類抗氧化劑,可有效清除體內的氧自由基,減緩衰老,也可預防癌癥,而且還具有一定的抗菌作用[6]。因此,無論是在藥物還是在保健食品方面,屈曲花都有著廣闊的應用前景。

提取植物中黃酮類物質時,影響總黃酮得率的因素很多,而且在同一因素的不同水平下的總黃酮得率也會有很大差別。因此,需要綜合考慮選擇恰當的方法來優化提取工藝。傳統的提取中草藥黃酮類物質的方法主要有乙醇浸提法[7]、乙醇加熱回流提取法[8]、索氏回流法提取[8-9]等。這些方法雖然成本低、操作簡單,但是存在著損失大、周期長、工序繁瑣、得率低等缺點。近年來出現了許多新工藝,如超聲輔助提取[10]、微波輔助提取[11]、超高壓提取[12]等。這些新工藝的應用使得中草藥的提取既符合傳統的中醫理論,也使得有效成分的得率提高和達到了純度提高的目的。相比之下,超聲輔助提取不僅高效低廉,而且更易于實現工業化生產。

目前還沒有對屈曲花總黃酮提取工藝研究的報道。綜合考慮,本文利用超聲波輔助提取屈曲花中的總黃酮,并采用正交實驗設計對乙醇濃度、料液比、提取時間以及超聲功率這四個因素進行驗證和全面優化,以確定最佳提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

屈曲花種子廣州田野風園林綠化有限公司,干燥、粉碎后過60目備用;蘆丁標準品Sigma公司;95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產分析純。

KEUV-8500紫外可見分光光度計上海坤科儀器設備有限公司;SB-5200DTD超聲清洗儀蘇州江東精密儀器有限公司;FW100萬能高速粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司;FA1204B電子天平上海精密科學儀器有限公司;FD-1D-50壓蓋掛瓶型真空冷凍干燥機北京醫博康實驗儀器有限公司;CS101-3ANB電熱鼓風干燥箱重慶永生實驗儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液與標準曲線

1.2.1.1標準溶液的配制準確稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品10.00 mg,置于100 mL容量瓶中,加30%乙醇適量,超聲處理使溶解,放冷。稀釋、定容為0.10 mg/mL的標準溶液,貯存備用。

1.2.1.2標準曲線的繪制精密量取上述蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL分別置入7只25 mL容量瓶中,各加水至6 mL,加5% NaNO2溶液1 mL,搖勻,靜置6 min;加10% Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻,靜置6 min;加入4% NaOH溶液10 mL,定容至刻度,搖勻,放置15 min后立即在510 nm波長處測定吸光度(A),空白為不加入蘆丁標準液。以吸光度為橫坐標,濃度(C,mg/mL)為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2樣品的制備與樣品中總黃酮的測定屈曲花種子原材料于60 ℃的烘箱中干燥48 h后,用萬能粉碎機將其粉碎,然后真空冷凍干燥成粉,貯藏于干燥器內備用。精密稱取2.0000 g屈曲花粉末置200 mL燒杯中,加入20 mL 75%乙醇溶液,功率為200 W間歇式超聲波提取20 min,抽濾,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照1.2.1.2方法測定OD510 nm,并計算總黃酮得率。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比 1∶30(g/mL)分別加入體積分數為45%、55%、65%、75%、85%和95%的乙醇溶液,搖勻后靜置25 min。設置超聲功率80 W提取時間15 min,將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.3.2提取時間對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比 1∶30(g/mL)加入75%的乙醇溶液,搖勻后靜置25 min。設置超聲功率80 W,提取時間分別為5、10、15、20、30和40 min。將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.3.3料液比對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,分別加入75%的乙醇溶液20、40、60、80和100 mL,即料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70和1∶80 g/mL,搖勻后靜置25 min。設置超聲功率80 W,提取時間15 min。將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.3.4超聲波功率對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比1∶30(g/mL)加入75%的乙醇溶液,搖勻后靜置25 min。設置提取時間15 min,超聲功率分別為80、100、120、140、160和180 W。將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.4正交實驗在單因素實驗的基礎上,選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)和超聲波功率(D)四個因素的三個水平進行正交實驗,建立L9(34)正交表,見表1,以屈曲花總黃酮得率(Y)為評價指標,采用SPSS statistic 19.0數據分析軟件,對實驗數據進行分析。

表1　正交設計實驗因素與水平Table 1　Factors and levels in the orthogonal design

1.3總黃酮得率的計算

總黃酮得率要根據標準曲線進行計算。每次實驗測定屈曲花提取液吸光度并將其換算成總黃酮的質量濃度,而后根據下列公式得出總黃酮得率:

式(1)

式中,C為提取液總黃酮的質量濃度(mg/mL);V為測量時定容體積(mL);V1為檢測時所取提取液體積(mL);V2為提取后定容體積(mL);m為屈曲花樣品質量(g)。

1.4數據統計分析

所有的實驗均重復3次,利用Excel、origin 7.5和SPSS statistic 19.0對實驗結果進行分析。

2　結果與討論

2.1標準曲線

根據1.2.1.2的實驗結果,以吸光度為橫坐標,濃度(C,mg/mL)為縱坐標,繪制標準曲線。蘆丁標準品溶液在實驗中的質量濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系,線性回歸方程為:

C=0.0863A-0.0002,R2=0.9996

式(2)

式中,C為蘆丁濃度(mg/mL);A為吸光度值。

2.2單因素實驗

2.2.1乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響由圖1可知,乙醇濃度在 45%～85%范圍內時,隨著乙醇濃度增加,屈曲花總黃酮得率增加,但乙醇濃度超過85%時,屈曲花總黃酮得率反而下降。根據相似相溶原理,極性相近可達到最大溶出度。當乙醇濃度小于85%時,隨著乙醇濃度的增大,乙醇對屈曲花顆粒的作用力增強,促進了黃酮類物質在乙醇溶液中的溶解,從而使得總黃酮提取率增加;當乙醇濃度大于85%時,溶劑的極性減弱,與黃酮類物質的極性差距增加,從而導致黃酮類物質溶出率下降,總黃酮提取率反而降低。因此,選取乙醇濃度75%、85%和95%作為正交實驗條件。

圖1　乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.2.2提取時間對屈曲花總黃酮得率的影響由圖2可知,在10 min內,隨時間的延長,屈曲花總黃酮提取率幾近線性增加。超過10 min后,屈曲花總黃酮不再增加,反而線性下降。隨著超聲時間的延長,溶劑充分浸透屈曲花顆粒,促進了顆粒中總黃酮的充分溶出,使得總黃酮提取率增加。超聲時間過久,超聲波的空化效應會破壞某些黃酮類物質并使其分解。因此,選擇超聲時間5、10和15 min作為正交實驗條件。

圖2　提取時間對總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2.3料液比對屈曲花總黃酮得率的影響由圖3可知,料液比在1∶30～1∶60范圍內時,屈曲花總黃酮得率隨料液比的增加顯著提高。其原因可能是隨著料液比的增加,屈曲花顆粒與乙醇溶劑之間的接觸面也增加,提高了黃酮類物質向溶劑中轉移的擴散系數,使得原料中更多的黃酮溶入提取劑中。當料液比超過1∶60 時,黃酮的提取率有明顯的下降趨勢。因此,選擇料液比1∶50、1∶60和1∶70 g/mL作為正交實驗條件。

圖3　料液比對總黃酮得率的影響Fig.3　Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.2.4超聲波功率對屈曲花總黃酮得率的影響由圖4可知,當超聲波功率在80～100 W時,隨著超聲波功率的增大,超聲波的作用逐漸加強,屈曲花總黃酮得率緩慢增加。當超聲波功率達到100 W 時,屈曲花中總黃酮得率達到最大,之后呈下降的趨勢。超聲功率的增大,促進了黃酮類物質從屈曲花顆粒內部溶出,從而使得總黃酮提取率增大;而較大超聲波功率可能使屈曲花中的某些黃酮類成分遭到破壞,導致黃酮得率有所下降。更重要的是,不同超聲波功率下的總黃酮得率之間并沒有顯著性差異。因此,選擇超聲波功率80、100和120 W作為正交實驗條件。

圖4　超聲波功率對總黃酮得率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic power on extraction yield of total flavonoids

2.3正交實驗

以單因素實驗結果為基礎,選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)和超聲波功率(D)四個因素為自變量,以屈曲花中總黃酮得率(Y)為指標,根據相應的實驗,計算出總黃酮得率,實驗方案及結果見表2,方差分析結果見表3。

由表2極差分析可知,影響屈曲花中總黃酮得率的四個因素順序為:A(乙醇濃度)>B(提取時間)>C(料液比)>D(超聲波功率)。方差分析表3顯示乙醇濃度對屈曲花中總黃酮得率影響表現極顯著(p<0.01),提取時間對屈曲花中總黃酮得率影響表現顯著(p<0.05)。正交實驗設計得出的最佳提取工藝條件組合為A2B3C3D2,即乙醇濃度為85%,提取時間為15 min、料液比為1∶70和超聲波功率100 W。在該優化條件下平行實驗3次,總黃酮平均得率為2.456%。

表2　屈曲花黃酮提取工藝L9(34)正交實驗方案及結果Table 2　Experimental design and corresponding results of orthogonal design

表3　方差分析結果Table 3　Variance analysis

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00；**為差異極顯著(p<0.01),*為差異顯著(p<0.05)。

3　結論

本文在單因素實驗基礎上,利用實驗設計軟件SPSS statistic 19.0優化了屈曲花總黃酮提取工藝條件。在正交實驗設計所選條件范圍內,乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響最大,其次為提取時間,然后是料液比,超聲波功率影響最小。正交實驗設計得出的最佳提取工藝條件為乙醇濃度85%、提取時間15 min、料液比1∶70、超聲功率100 W。在該優化條件下平行實驗3次,總黃酮平均得率為2.456%。

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Optimization on the ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromIberisamarabased on orthogonal experimental design

DENG Si-jie,HANS Gregrensen*

(Key Laboratory of Biorheological Science and Technology,Ministry of Education College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China)

Orthogonal experimental design was applied to optimize the extraction process of total flavonoids fromIberisamarausing an ultrasonic-assisted extraction method in this study. The effects of ethanol concentration,extraction time,solid-to-liquid ratio and ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids were investigated by single-factor experiment,and then the extraction conditions were optimized by orthogonal experimental design. The results displayed that the ethanol concentration was the most key factor,followed by extraction time,solid-to-liquid ratio and ultrasonic power,in turn. The best extraction conditions were obtained as follows:ethanol concentration 85%,solid-to-liquid ratio 1∶70,extraction time 15 min and ultrasonic power 100 W. Under these optimized conditions,the yield of total flavonoids fromIberisamarawas 2.456%. This study offered not only a reference standard for industrial applications,but also has a promising prospect and value for widely exploitation and utilization ofIberisamararesource.

Iberisamara;flavonoids;ultrasonic-assisted extraction;orthogonal experiment

2015-06-18

鄧思節(1990-),女,碩士研究生,研究方向:天然產物的分離與提取,E-mail:18875208325@163.com。

漢斯·格里格森(1962-),男,博士,教授,研究方向:軟組織生物力學及新型醫療器械,E-mail:hag@giome.org。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0275-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.049