對甜菜夜蛾具有殺蟲活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

王　楊,　周子珊,　劉永磊,　韓　榕,　張林靜*,　張　杰*

(1. 山西師范大學生命科學學院,臨汾　041004; 2. 中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京　100193)

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對甜菜夜蛾具有殺蟲活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

王楊1,2,周子珊2,劉永磊2,韓榕1,張林靜1*,張杰2*

(1. 山西師范大學生命科學學院,臨汾041004; 2. 中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京100193)

根據已報道的14個cry1Ca基因,設計能夠擴增cry1Ca全長基因的簡并引物。利用該引物對本實驗室分離的472株Bt菌株進行篩選。PCR擴增發現22株菌含有cry1Ca基因。對22株菌株進行cry基因多樣性分析,結果獲得5種類型酶切圖譜,表明這些菌株分為5種類型。SDS-PAGE結果顯示22株菌均表達約130 ku的蛋白。Western Blotting結果證實這些株菌中cry1Ca基因均正常表達。提取菌株的晶體蛋白,經胰蛋白酶活化,對甜菜夜蛾[Spodopteraexigua(Hübner)]進行初步生測,結果表明22株菌中活化的Cry蛋白對甜菜夜蛾均表現出很強的毒殺作用。進一步從5個類型的菌中各挑選一株毒力較高的菌株進行LC50的測定,結果證實它們均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087 μg/g)、B16-C8(0.103 μg/g)、T1-B8(0.202 μg/g)的活性與陽性對照菌株G03(0.090 μg/g)相當,具有生產應用潛力。本研究為新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基礎。

蘇云金芽胞桿菌;cry1Ca基因;甜菜夜蛾;致死中濃度

甜菜夜蛾[Spodopteraexigua(Hübner)]屬鱗翅目夜蛾科,作為一種世界性的多食性害蟲,長期為害包括棉花、番茄、大豆等在內的重要經濟作物[1]。在中國,甜菜夜蛾的為害程度日趨嚴重,給農業生產造成巨大損失[2]。由于化學殺蟲劑的濫用,已導致害蟲抗性上升、環境污染等嚴重后果。因此,亟待加強Bt等生物農藥的研究和利用。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt),是一種能夠特異性毒殺害蟲的革蘭氏陽性細菌,殺蟲活性主要由cry基因所編碼的殺蟲蛋白起作用[3]。由于Bt殺蟲蛋白具有對靶標害蟲特異性毒殺以及對非靶標生物如小鼠、人等哺乳動物安全、無毒害等特點[4-5],已經成為世界上應用最為廣泛的微生物殺蟲劑[6-7]。1988年第一個cry1Ca基因被克隆,1990年Honée首次報道了這個cry1Ca基因表達產物對甜菜夜蛾具有高毒殺作用[8]。迄今為止,全球已有14個cry1Ca基因公布,來自我國的cry1Ca基因數量達到8個(Bt殺蟲蛋白國際命名委員會網站—http:∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。國內多家單位先后篩選出對甜菜夜蛾高毒力的Bt菌株,如S18-4[9]、WY-190[10]和Hcy系列[11]、CZE99985[12]、G03[13]等菌株。

本實驗室在前期篩選對甜菜夜蛾高毒力菌株的基礎上[14],繼續加大力度,采用菌株分型結合PCR-RFLP技術,選取了已報道對甜菜夜蛾具有高毒力的cry1Ca基因[8,15-16]作為切入點,對我們近兩年新分離的Bt菌株進行活性篩選與基因鑒定,發掘對甜菜夜蛾具有高效殺蟲活性的菌株,發現了一批高毒力菌株,這些菌株的共同特點就是都含有cry1Ca基因。本研究為高效毒殺甜菜夜蛾的Bt菌株的發掘與利用創造了條件。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1研究菌株來源

472株野生Bt菌株為本實驗室從國內土壤中分離、篩選并保存。

陽性對照菌株:HD-1Ca7(cry1Ca7基因轉入HD 73-工程無晶體突變株),以及G03野生Bt菌株,含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ca、cry2Ab基因,是由河北農林科學院植保所分離,對甜菜夜蛾等夜蛾科害蟲具有高毒力。

1.1.2培養基

液體LB培養基:胰蛋白胨 1%,酵母抽提物0.5%,NaCl 1%,pH調至7.0,121 ℃滅菌20 min。

液體1/2 LB培養基:胰蛋白胨 0.5%,酵母抽提物 0.25%,NaCl 0.5%,調pH至7.0,121 ℃滅菌20 min。

1.1.3試蟲及人工飼料來源

甜菜夜蛾試蟲由武漢科諾生物科技股份有限公司提供;甜菜夜蛾試蟲人工飼料由中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲組提供。

1.1.4主要生化試劑

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;核酸聚合酶、限制性內切酶以及標準DNA、蛋白marker購自大連TaKaRa寶生物工程有限公司;胰蛋白酶(1∶250)購自北京索萊寶生物科技有限公司;第一抗體:小鼠來源單抗,購自美國一龍(Envirologix)公司;第二抗體:HRP標記的羊抗鼠單抗,購自美國Sigma公司;顯色液:SuperSignal?West Pico Chemiluminescent Substrate試劑盒購自Thermo Scientific公司。

1.2試驗方法

1.2.1cry1Ca基因簡并引物設計

通過從Bt殺蟲蛋白國際命名委員會網站—http:∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/網址查詢獲得目前已報道的cry1Ca第4等級基因共有14個,除cry1Ca10、cry1Ca14外的12條基因編碼序列能夠通過GenBank登錄號從NCBI上下載;將12條基因序列進行多序列比對,設計出能夠擴增cry1Ca基因全長的簡并引物。

設計引物序列,上游引物5′-ATGGAGGAAAATAATCAAAATC-3′,下游引物5′-ATTASTCCTTATGGAGGAATAA-3′。

1.2.2Bt菌株基因組DNA的提取

基因組DNA提取參考張彥蕊等[17]的方法。

1.2.3Bt菌株cry1Ca基因鑒定

對472個基因組進行分組,以5～7個菌株基因組混合作為一組模板,利用cry1Ca基因簡并引物首先進行第一輪PCR擴增,然后對能夠擴增出信號的混合基因組再分別進行第二輪篩選,最終確定到菌株。

PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸3.5 min,30次循環;72 ℃延伸10 min。

PCR反應體系:2×PCRTaqMixture 10 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,超純水7 μL,總計20 μL體系。

1.2.4cry1Ca基因的擴增、克隆與測序分析

包括Cry1Ca原毒素在內的所有130 ku Cry蛋白都包含一個位于N末端、600氨基酸的活性區域[18](C末端與殺蟲作用無關)。因此從基因的5′端到約2.2 kb設計引物,利用PrimeStar高保真聚合酶擴增,產物連接載體送測序。設計引物序列:上游引物5′-ATGGAGGAAAATAATCAAAATC-3′,下游引物5′-AATTAAAAGCTTATACCCGT-3′。

PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35次循環;72 ℃延伸10 min。

PCR反應體系:2×PrimeStar 10 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,超純水7 μL,總計20 μL體系。

測序交由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.2.5菌株晶體形態觀察

利用1/2 LB培養基對供試菌株培養30 h,BX 63顯微鏡(日本Olympus)進行100×油鏡觀察并拍照,具體方法參見文獻[19]。

1.2.6菌株cry基因多樣性分析

采用PCR-RFLP技術對篩選出的野生菌株進行cry基因類型的多樣性分析;簡并引物及PCR-RFLP流程參考束長龍建立的方法[20]。該對簡并引物是作者根據多類cry基因的保守區同源序列經過聚類分析所設計,利用HinfⅠ限制性內切酶對擴增產物進行酶切,能夠展示出不同帶型的酶切圖譜,有助于對不同Bt菌株的cry基因組成進行差別鑒定。

參考引物序列:上游引物con_1f序列5′-TATGCWCAAGCWGCCAATYTWCATYT-3′,下游引物con_5r序列5′-GGRATAAATTCAATTYKRTCWA-3′。

PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,38 ℃退火2 min,72 ℃延伸2 min,30次循環;72 ℃延伸10 min。

PCR反應體系:2×PCRTaqMixture 15 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,超純水12 μL,總計30 μL。

PCR酶切體系:PCR產物10 μL,酶切緩沖液3 μL,HinfⅠ 1 μL,超純水16 μL,37 ℃反應2 h。

1.2.7Cry蛋白提取、胰蛋白酶消化以及定量

菌株Cry蛋白提取采用1/2 LB液體培養基、重復溶解的方法進行提取,具體詳見Zhou等的方法[19]。菌株提取Cry蛋白的SDS-PAGE分析參考薩姆布魯克等[21]的方法進行;并以1.0 μg(濃度為0.2 mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白進行條帶定量,定量采用圖像分析軟件(Image J)測定電泳條帶灰度值,并根據標準BSA濃度計算Cry蛋白濃度。參考Bravo文獻[22]選擇胰蛋白酶(1∶250)對提取的Cry蛋白進行消化:按照質量比1∶10(胰蛋白酶∶Cry蛋白質)加入胰蛋白酶,37 ℃下消化2 h,繼而對消化蛋白條帶進行SDS-PAGE分析、定量。

1.2.8Western Blotting對篩選菌株cry1Ca基因表達檢測

對供試菌株所提取Cry蛋白的消化產物進行10% SDS-PAGE電泳:2塊凝膠重復,其中1塊作為平行膠進行考馬斯亮藍染色,另一塊用于Western Blotting分析。利用eBlot快速轉印儀(中國Genscript)10 min將膠上蛋白轉移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉(1×TBS-T溶解)室溫封閉2 h;1×TBS-T漂洗3次,每次10 min;加入TBS-T稀釋的鼠抗Cry1Ca蛋白單克隆抗體(1∶1 000),室溫孵育1 h;1×TBS-T漂洗3次,每次10 min;加入HRP標記的羊抗鼠二抗(1∶2 000),室溫孵育1 h;1×TBS-T漂洗3次,每次10 min;膜上加顯色液,利用ImageQuant LAS 4000 mini凝膠成像儀(美國GE Healthcare)進行曝光、拍照。

1.2.9甜菜夜蛾殺蟲活性的測定

甜菜夜蛾殺蟲活性的初步測定:處理組樣品為所篩選22株野生Bt菌株、對照菌株G03、HD-1Ca7菌株提取的Cry蛋白,共計24組;添加一定比例胰蛋白酶的50 mmol/L Na2CO3(pH=10.0)溶液設立為陰性對照組。按照10 g/重復稱取人工飼料分別置于規格為60 mm的培養皿中,分別加入1 mL待測樣品溶液,并將其充分混合均勻。每處理組設初始濃度70 μg/g、1/10初始濃度7 μg/g,每個濃度2個重復,每重復接初孵試蟲30頭。完成分裝并放置于26 ℃光照培養箱(光周期L∥D=12 h∥12 h)進行為期7 d的培養。每天檢查培養箱內溫度、相對濕度及飼料是否變質;到期分別調查試蟲死、活蟲數目,統計并計算校正死亡率[23]。校正死亡率計算公式如下:

校正死亡率(%)=[(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)]×100%。

菌株LC50值測定:選擇對照菌株G03、HD-1Ca7菌株以及經PCR-RFLP分析、cry基因組成有差異的菌株進行復篩;LC50梯度設立6.000、2.000、0.667、0.222、0.074、0.025 μg/g共6個濃度,每個濃度3個重復,每重復接30頭初孵試蟲,其他流程同初篩。參考Vincent[24]的方法,利用SPSS 13.0軟件進行LC50值的計算。

2　結果與分析

2.1含有cry1Ca基因菌株鑒定與測序分析

利用所設計引物對472個提取的野生Bt菌株基因組進行PCR擴增,經過瓊脂糖凝膠電泳,最終篩選發現22株野生Bt菌株能夠擴增出大小為3 570 bp的明顯條帶(圖1)。測序結果同已知的cry1Ca基因進行比對,結果發現22條基因5′端到約2.2 kb序列同cry1Ca7基因的活性區域序列完全相同。

圖1　22株Bt菌株中cry1Ca基因PCR擴增鑒定結果Fig.1 Amplification results of cry1Ca gene from 22 Bt isolates by PCR

2.2菌株晶體形態觀察

對22株Bt菌株進行光學顯微鏡晶體形態觀察,發現這22株菌株晶體均呈現出與參照菌株G03一致的雙錐體形(圖2)。

圖2　部分Bt菌株晶體形態的光學顯微鏡觀察結果Fig.2 Morphology of partial Bt isolates under optical microscope

2.3利用PCR-RFLP對篩選菌株進行cry基因多樣性鑒定

利用該對簡并引物對22株野生菌株進行PCR擴增,結果顯示從這些菌株基因組中均能夠擴增出一條大小約為1.4 kb的明顯條帶(圖3a);繼而對擴增的1.4 kb條帶進行HinfⅠ限制性內切酶酶切,經2%瓊脂糖凝膠電泳,結果展示出不同酶切圖譜(圖3b)。對酶切圖譜條帶數目以及大小進行分析,確定這22個樣品酶切帶型匯總為5類(圖3c),其中類型1對應菌株為B16-C8;類型2對應菌株為C12-C8、T1-A2、T1-A5、T1-D7、T1-F10、T3-C12、T3-E10、T4-C10、T5-E8共9株;類型3對應菌株為T1-B8;類型4為T1-E12、T1-F1、T2-C8、T2-D2、T2-C12、T2-D10、T3-A8共7株;類型5為B15-B4、T1-E10、T1-E9、T2-C5共4株。G03菌株PCR-RFLP結果(圖3d),其酶切圖譜與類型2相似。

圖3　22株Bt菌株cry基因PCR-RFLP鑒定結果Fig.3　Identification results of cry genes of 22 Bt isolates by PCR-RFLP

2.4Cry蛋白提取、消化、定量

對供試菌株提取的Cry蛋白進行SDS-PAGE分析,結果顯示菌株均表達分子量大小約為130 ku的蛋白(圖4)。按照條帶掃描情況計算出了Cry蛋白濃度;利用胰蛋白酶按照比例消化原毒素,圖5是2 h消化結果,130 ku消失,蛋白條帶集中于60 ku附近,并完成了消化條帶的定量計算。

2.5Western Blotting分析結果

利用Cry1Ca抗體對Cry蛋白消化產物進行Western Blotting分析,結果顯示,樣品在60 ku均獲得較好雜交條帶(圖6 b),與Cry1Ca陽性對照一致。

圖4　部分Bt菌株提取Cry蛋白原毒素的SDS-PAGE分析Fig.4 Partial results of SDS-PAGE analysis of protoxin extracted from screened Bt strains

圖5　胰蛋白酶活化Cry蛋白樣品分析結果Fig.5 Analysis of Cry protein digested with trypsin

2.6甜菜夜蛾殺蟲活性的測定結果

經定量計算的Cry蛋白消化產物,取終濃度為70、7 μg/g分別對甜菜夜蛾進行初步生測,結果說明供試菌株對甜菜夜蛾均有較高毒力(表1);在70 μg/g濃度下,22株菌株校正死亡率在96%以上(19株菌同對照菌株G03、HD-1Ca7,校正死亡率為100%),且存活蟲體大小同初孵,無明顯增長;7 μg/g濃度下,有18株菌校正死亡率在90%以上,3株菌校正死亡率在84%～90%之間,1株為75.4%。

圖6　Western Blotting分析結果Fig.6　Analysis of Cry1Ca proteins by Western Blotting

菌株Strain70μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality7μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality菌株Strain70μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality7μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%CorrectedmortalityB16-C8100.0100.096.796.5T2-C8100.0100.096.796.5C12-C898.298.194.794.4T2-D2100.0100.098.598.4T1-A2100.0100.095.094.7T2-C12100.0100.098.398.2T1-A5100.0100.096.696.4T2-D10100.0100.096.896.6T1-D7100.0100.076.775.4T3-A8100.0100.098.398.2T1-F10100.0100.085.584.7B15-B4100.0100.098.498.3T3-C12100.0100.089.889.2T1-E10100.0100.090.389.8T3-E10100.0100.0100.0100.0T1-E9100.0100.0100.0100.0T4-C10100.0100.093.493.0T2-C5100.0100.095.094.7T5-E8100.0100.096.796.5G03(CK+)100.0100.088.387.7T1-B8100.0100.0100.0100.0HD-1Ca7(CK+)100.0100.098.398.2T1-E1296.896.696.696.4Na2CO3(CK-)5.2—T1-F198.498.396.696.4

1) 左欄22個Bt菌株樣品從上至下按照5類PCR-RFLP酶切圖譜以虛線相隔,進行排序。Na2CO3: 50 mmol/L, pH=10.0。

22 Bt isolates in the left column are sorted from top to bottom by 5 patterns of restriction fragment which are separated by dotted line. Na2CO3: 50 mmol/L, pH=10.0.

根據初步生測活性結果并結合基因鑒定酶切圖譜差異分析,從5個類型Bt菌株中各選取1株毒力高的為代表(B16-C8、C12-C8、T1-B8、T1-E12、T1-E10)進行LC50測定;生測結果表明(表2),T1-E12(0.087 μg/g)、B16-C8(0.103 μg/g)、T1-B8(0.202 μg/g)的活性很高,與陽性對照菌株G03(0.090 μg/g)相當;而菌株C12-C8(0.610 μg/g)、T1-E10(0.677 μg/g)的LC50接近,毒力分別比對照菌株G03低6.8倍和7.5倍。

表2　Bt活化毒素對甜菜夜蛾生物活性測定結果Table 2　Bioassay results of Bt toxins against the larvae of Spodoptera exigua

3　討論

70多年來,Bt菌株作為微生物殺蟲劑已經取得了巨大的成功[6]。雖然Bt在生物農藥中所占比例最高,但整個生物農藥在農藥中所占比重還非常小,因此針對甜菜夜蛾等重要害蟲新型高效Bt菌株的挖掘仍然有很大的發展空間。

本研究以對甜菜夜蛾高毒力的cry1Ca基因鑒定入手,從472株野生Bt菌株中成功篩選到22株包含cry1Ca基因的野生Bt菌株,并通過Western Blotting分析證實了這些cry1Ca基因的表達。利用本實驗室近期建立的、基于PCR-RFLP技術進行菌株分型[20],將這些菌株分為5種類型。在此基礎上,篩選到T1-E12、B16-C8和T1-B8三個菌株,它們對甜菜夜蛾幼蟲的活性與陽性對照G03菌株相當。G03菌株是由河北農林科學院植物保護研究所在執行“八五”攻關項目期間分離獲得的,對甜菜夜蛾、棉鈴蟲等夜蛾科以及小菜蛾、亞洲玉米螟等害蟲具有高毒力。目前,該菌株已經作為受體菌構建了對鱗翅目、鞘翅目害蟲的工程菌株,并于2014年12月獲得農業部頒發的轉基因生物生產應用證書[13],正在進行農藥登記。這3個高毒力菌株的獲得,將豐富我國殺蟲菌株資源,為新型Bt生物農藥產業化奠定了基礎。

cry1Ca第四等級基因自1988年到2015年共報道14個(其中由中國提交的基因有8個,占57.1%);而cry1Ac第四等級基因從1985年到2015年,共報道發現38個(其中由中國提交的基因有16個,占42.1%)(Bt殺蟲蛋白國際命名委員會網站http:∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/),cry1Ca基因的總數遠低于cry1Ac基因。從基因鑒定的層面發現,在野生Bt菌株中的豐度和分布,前者遠遠低于后者[25-26]。由此推測:在自然界中,cry1Ca基因可能比cry1Ac基因更加保守,而且在自然界中分布有限。本文研究結果也印證了這一點:472個菌株僅有22個菌株含有cry1Ca基因,而且5種類型的22個菌株中的cry1Ca基因全部為cry1Ca7。因此若要挖掘新型cry1Ca基因仍需付出更大的努力。

Western Blotting結果證明這些菌株中cry1Ca基因都表達了Cry1Ca蛋白,生物活性測定結果顯示供試菌株活化蛋白展示了很高的殺蟲活性;但是這樣的高活性是僅僅來自于Cry1Ca蛋白的單獨貢獻,還是其他Cry蛋白協同增效,仍然需要進一步深入研究。

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(責任編輯：田喆)

Analysis ofcry1Cagene fromBacillusthuringiensisstrains with high insecticidal activity againstSpodopteraexigua

Wang Yang1,2,Zhou Zishan2,Liu Yonglei2,Han Rong1,Zhang Linjing1,Zhang Jie2

(1. School of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen041004, China;2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

One pair of degenerate primers, designed based upon the 14 known sequences ofcry1Cagenes, was used to identifycry1Cagenes from 472 wild isolates ofBacillusthuringiensisscreened in our laboratory, and there were 22 isolates containingcry1Cagenes. Five patterns of restriction fragment were obtained by the analysis ofcrygene diversity depended on PCR-RFLP, indicating that 22B.thuringiensisisolates could be classified as five types. SDS-PAGE analysis results showed that a main protein band with approximate 130 ku molecular mass was detected in each strain. Western Blotting analysis results also demonstrated that Cry1Ca proteins were expressed normally in all of the 22 strains. The preliminary bioassay was conducted with trypsin-activated Cry proteins extracted from 22 Bt isolates against the neonate larvae ofSpodopteraexigua(Hübner). The results showed that all of these strains hade high insecticidal activity against target larvae. The LC50values of the five selected Bt isolates representing five types againstS.exiguawere measured, and the results indicated that the toxicity of the five strains was very high; the insecticidal activity of the strains T1-E12 (0.087 μg/g), B16-C8 (0.103 μg/g) and T1-B8 (0.202 μg/g) was similar to that of the positive strain G03 (0.090 μg/g), and these strains have great potential for commercialization. Our findings will lay the foundation for discovery of novelB.thuringiensisisolates.

Bacillusthuringiensis;cry1Cagene;Spodopteraexigua;LC50

2015-03-16

2015-04-12

國家“863”計劃(2011AA10A203)；轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08009-003-001-004)

E-mail:jzhang@ippcaas.cn; linjingzh@aliyun.com

S 476.11

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.004

致謝：感謝武漢科諾生物科技股份有限公司劉華梅博士提供甜菜夜蛾試蟲,感謝中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲研究組梁革梅研究員提供人工飼料