楊樹潰瘍病生防菌株的抑菌機理研究

楊　蕾,　周國英,　梁　軍*

(1.中南林業科技大學,經濟林培育與保護教育部重點實驗室, 長沙　410004; 2. 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所, 國家林業局森林保護重點實驗室, 北京　100091)

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楊樹潰瘍病生防菌株的抑菌機理研究

楊蕾1,2,周國英1,梁軍1,2*

(1.中南林業科技大學,經濟林培育與保護教育部重點實驗室, 長沙410004; 2. 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所, 國家林業局森林保護重點實驗室, 北京100091)

黃綠木霉YGF9菌株和木賊鐮刀菌LX6F2菌株分別為分離自楊樹組織和楊樹林土壤中的2株生防菌。為了研究黃綠木霉和木賊鐮刀菌對楊樹潰瘍病菌葡萄座腔菌的生防抑菌機制,從生防菌株對病原菌代謝系統和生理生化的影響2個方面研究了生防菌株的抑菌機制。結果表明,兩生防菌株發酵液的正丁醇提取物可降低病原菌菌體的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)與輔酶I的活性,使Na+,K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性急劇下降;兩生防菌株可顯著提高病原菌菌絲體的電導率和丙二醛(MDA)含量,降低病原菌蛋白質含量。說明兩生防菌株可通過影響病原菌的代謝系統和生理過程來發揮其抑菌作用。

楊樹潰瘍病;黃綠木霉;木賊鐮刀菌;生防菌株;抑菌機理

楊樹潰瘍病是危害楊樹生長的主要枝干病害,大面積楊樹潰瘍病的發生會破壞生態環境,帶來巨大的經濟損失。楊樹潰瘍病是一種寄主主導型病害,在防治上存在較大難度。生防菌不僅在抑制病原菌生長方面具有很強的專一性、持久性和有效性,而且可以增強寄主植物的抗性,是目前林木病蟲害防治的主要研究方向。

植物在長期的進化過程中形成了抵御真菌、細菌和病毒等病原菌侵襲的防衛機制。主要包括：系統獲得性抗性(systemic acquired resistance, SAR),它是寄主植物被病原菌侵染后增強抵抗力做出的主要防御反應[1];誘導系統抗性(induced systemic resistance, ISR),它是指某些生防菌除了能直接抵御病原菌的侵入,還能誘導植物對病原菌產生抗性[2]。生防菌株抑制病原菌的機理包括通過競爭、重寄生、產生抗性物質、引起病原菌生理生態變化等[3]直接的拮抗機制來抑制植物病害的發生,同時在其他一些防御措施有限或是缺失的情況下,SAR和ISR的聯合作用可以作為其他保護防御措施的補充。研究認為在有機物復雜的生態系統中,多種防病機制的交錯聯合作用與單一的作用相比更能適應環境,效果更持久,這也是很多人工合成的化學農藥不能達到的效果[4-5]。生物防治作用機制的多樣性和復雜性,為其良好的防治效果提供了前提條件。

在前期的研究中,本實驗室以楊樹潰瘍病病原葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)為靶標菌株,分別從楊樹組織和楊樹林土壤中分離篩選到2株對楊樹潰瘍病有良好生防效果的生防菌株YGF9和LX6F2。經鑒定,菌株YGF9是一株黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)[6],菌株LX6F2是一株木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)[7]。為明確菌株YGF9和LX6F2對病原菌的作用機理,本研究從生防菌株對病原菌代謝系統的影響以及對病原菌生理生化的影響這兩方面對生防菌株的抑菌機制進行探索研究,以期掌握2株生防菌的作用機理,為楊樹潰瘍病的生物防治提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

病原菌：葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)由中國林業科學研究院森林保護重點實驗室菌種保藏中心提供,編號為72②B,在PDA培養基上繁殖保存;生防菌株YGF9和LX6F2由本實驗室分離篩選獲得,在PDA培養基上繁殖保存。生防菌YGF9采用的液體發酵培養基配方為：土豆浸汁200 g/1 000 mL,果糖1%,牛肉浸粉1.4%,KCl 0.1%;發酵條件為：起始pH 7.0,溫度34℃,轉速190 r/min,接種量3.5%,裝液量100 mL/250 mL。生防菌LX6F2采用的液體發酵培養基配方為：土豆浸汁200 g/1 000 mL,果糖1%,牛肉浸粉1.4%,KCl 0.1%;發酵條件為：起始pH 7.0,溫度32℃,轉速180 r/min,接種量4%,裝液量100 mL/250 mL。

馬鈴薯瓊脂糖培養基(potato dextrose agar, PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 15～20 g、加水定容至 1 000 mL,高壓蒸汽滅菌20 min。

試劑：培養基所需試劑購于北京福爾徹科技有限公司,酶活性測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

儀器：MLS-3750全自動高壓蒸汽滅菌鍋,日本SANYO公司;全能臺式高速冷凍離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司;MD2000微量紫外分光光度計,北京托摩根生物科技有限公司;BEC-11AW電導儀,貝爾分析儀器有限公司。

1.2試驗設計

1.2.1生防菌株發酵液預處理及高效抑菌活性物質的提取

1.2.1.1生防菌株發酵液預處理

取600 mL發酵4 d的發酵液,用1 mol/L草酸調節pH至3.0,室溫下靜置3 h,再用1 mol/L NaOH調pH為7.0,10 000 r/min離心10 min,保留上清液待用。離心后的菌體沉淀用200 mL 0.85%無菌生理鹽水懸浮,置于4℃冰箱靜置過夜。將處理后的菌體沉淀懸液進行細胞超聲破碎,破碎條件為450 W,破碎15 s,間歇10 s,破碎90次,保護溫度20℃。取超聲破碎后的上清液進行生物活性測定。

生物活性測定方法為：取超聲破碎后的上清液0.1 mL與冷卻至40℃左右的已滅菌PDA培養基混合均勻制成平板,接入直徑為4 mm 預先活化好的指示菌塊,以不加上清液的PDA培養基為對照,設3個重復。28℃下培養5 d后測量菌落直徑,計算抑菌率,如抑菌效果良好則證明發酵液預處理方法得當。

1.2.1.2生防菌株發酵液活性物質提取方法的選擇

將破碎后的細胞懸液6 000 r/min離心10 min,得到的上清液與細胞破碎前的上清液合并,棄沉淀。以石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、異戊醇和正丁醇6種有機溶劑作為萃取劑,按發酵液∶萃取劑=1∶3(V/V)常溫浸泡上述發酵液,48 h后分液去除無機相,減壓旋轉蒸發去除有機相。用進行萃取的超聲破碎上清液和發酵上清液的1/10體積的5% Tween 80溶液溶解萃取物,同時將未萃取的發酵液旋轉蒸發濃縮到原體積的1/10,備用。為減少活性物質丟失,需進行3次萃取,合并萃取后的有機相,減壓濃縮待用。通過測定抑菌率來確定最適宜的提取劑。

抑菌活性測定：采用菌絲生長抑制法,取上述提取物添加到PDA培養基中,搖勻,使提取物終濃度達到20%。倒平板,接入病原菌,以不添加提取物而只添加5% Tween 80溶液的PDA平板培養作為對照,25℃ 恒溫培養。采用十字交叉法,每8 h測1次菌落直徑,計算生防菌株發酵液不同溶劑提取物對病原菌生長的抑制率,每處理3次重復。抑菌率(%)=[(對照凈生長量-處理凈生長量)/對照凈生長量]×100。

1.2.2生防菌株對病原菌代謝系統酶和生理生化指標的影響

根據1.2.1.2的篩選結果,選擇最佳溶劑提取物進行如下試驗。將PD培養基中培養5 d的直徑約為2 cm病原菌菌絲團用無菌水洗凈后置于20 mL含10%生防菌株發酵液提取物的無菌水中,靜置。分別于2、4、6、8、10、12、24、48 h后測定各項代謝酶活性和生理生化指標,以5% Tween 80代替發酵液作為空白對照[8],每個時間段的處理重復3次,測定指標時再重復3次。

測定的病原菌代謝系統的重要酶包括：保護酶系統中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO);糖酵解途徑中己糖激酶(Pexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)與乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH);TCA循環中琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase,SDH)與蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH);輔酶I含量和ATP酶。酶活力測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行測定,具體方法詳見說明書。

測定的病原菌生理指標包括電導率、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和蛋白質含量等3個指標。電導率測定利用電導儀完成，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法，蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍染色法。

2　結果與分析

2.1生防菌株發酵液活性物質的初步提取

2.1.1生防菌株預處理效果

將發酵過濾液、超聲破碎后的上清液及超聲破碎后的菌泥分別進行抑菌活性的測定,各組分的抑菌效果見表1。結果表明,各處理組分的抑菌效果呈極顯著差異(P=0.000),經超聲破碎后,菌株YGF9的超聲破碎上清液的抑菌率為84.85%,菌株LX6F2的超聲破碎上清液的抑菌率為86.68%,高于未經處理的原始發酵液過濾液,說明預處理使生防菌株胞內的部分抑菌活性物質得到了有效的釋放。

表1　發酵液預處理各組分抑菌效果1)Table 1　Antifungal effects of each component of the pretreated fermentation liquids

1) 表中數據為平均值±標準差。“-”表示無抑菌活性。同列數據后不同字母表示經Duncan氏新復極差法多重比較在P<0.05水平差異顯著。

Data are mean±SD. “-”indicates no inhibition effect. Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level by Duncan’s new multiple range test.

2.1.2生防菌株抑菌活性成分的有效萃取劑

通過雙因素方差分析和同質性檢驗,發現兩菌株經不同有機溶劑萃取后的病原菌直徑及抑菌率均呈極顯著差異(P=0.000)。結果表明(表2),不同有機溶劑對兩生防菌株抑菌活性物質的萃取效果各不相同,但在用正丁醇進行萃取時,兩菌株的抑菌活性均達到最佳,明顯優于其他5種萃取劑。因此,確定正丁醇是兩株生防菌株抑菌活性物質最有效的萃取劑。此外,根據“相似相容”原理,可以初步判定菌株YGF9和LX6F2有效抑菌成分極性較弱。

表2　不同有機溶劑提取物對病原菌生長的影響1)Table 2　Effects of different extracts on pathogen’s growth

1) 數據為平均值±標準差,同列數據后不同小寫字母分別代表經LSD最小顯著差異性分析在P<0.05水平下差異顯著。

The data are mean±SD. Different lowercase letters in the same column represent significant difference at 0.05 level by LSD.

2.2生防菌株對病原菌代謝系統相關酶的影響

2.2.1對病原菌保護酶的影響

由圖1可知,經YGF9 和LX6F正丁醇提取物處理后的前8 h中,病原菌SOD酶活性與未經處理的對照組活性均呈平緩升高趨勢,在8 h時酶活性達到最大,經菌株YGF9提取液處理的病原菌SOD酶活性為37.00 U/(g·min),經菌株LX6F2提取液處理的病原菌SOD酶活性為43.00 U/(g·min)。8 h后,處理組的酶活性大幅持續降低,在48 h時酶活性達到最小,經菌株YGF9提取液處理的病原菌SOD酶活性為3.33 U/(g·min),經菌株LX6F2提取液處理的病原菌SOD酶活性為8.47 U/(g·min)。經生防菌株發酵液處理后,病原菌的SOD酶活性呈現先上升后大幅下降的趨勢,表明病原菌細胞膜脂的過氧化程度加重。

經YGF9和LX6F2發酵提取液處理后的前8 h中,病原菌CAT酶活性與未經處理的對照組活性的變化趨勢相似(圖1b),均呈升高趨勢,且每個時間段的增加幅度有一定差異;在處理后8 h時酶活性達到最大,經菌株YGF9提取液處理的病原菌CAT酶活性為0.054 7 U/(g·s),經菌株LX6F2提取液處理的病原菌CAT酶活性為0.051 2 U/(g·s)。8 h后,處理組的CAT活性快速下降,在24 h時,YGF9提取液處理組的CAT酶活性為0.011 9 U/(g·s),LX6F2提取液處理組的CAT酶活性為0.011 0 U/(g·s),在24 ～48 h中,酶活的下降速度減慢并趨于平穩。

經YGF9和LX6F2發酵提取液處理后的2～8 h中,處理組和對照組的POD活性均呈平穩緩慢上升(圖1),在8～12 h中,POD活性大幅增加,在12 h時,處理組的酶活性達到最大,分別為5.176 7 U/(g·s)和5.470 0 U/(g·s),而對照組酶活性的最大值則出現在24 h,為5.490 0 U/(g·s)。在處理12 h后,處理組的酶活性大幅快速下降,在48 h時降到最低。PPO酶活性的變化趨勢與SOD和CAT的變化趨勢相似,都呈現出先上升后下降的規律(圖1)。

2.2.2對糖酵解途徑中HK、PK與LDH活性的影響

如圖2所示,病原菌菌絲團經YGF9和LX6F2提取液浸泡后,其HK、PK與LDH的活性隨處理時間的增加而不斷降低,而未經處理的對照組酶活性則逐漸升高。HK、PK與LDH活性的顯著下降,說明生防菌株發酵液提取物嚴重干擾了病原菌糖酵解途徑的順利進行。

2.2.3對TCA循環中SDH與MDH活性的影響

試驗結果顯示經生防菌株發酵提取物浸泡處理后,病原菌的SDH和MDH酶活性均呈現逐漸降低并幾乎接近于零的趨勢(圖3),與對照組酶活性的不斷升高形成鮮明對比。上述結果說明,提取物抑制和破壞了病原菌的SDH和MDH酶活性,從而導致病原菌的TCA循環無法正常進行。

圖1　生防菌株對病原菌保護酶活力的影響Fig.1　Effects of the biocontrol strains on pathogen’s protective enzyme activities

圖2　生防菌株對病原菌糖代謝途徑中關鍵酶活力的影響 Fig.2　Effects of the biocontrol strains on pathogen’s key enzyme activities in sugar metabolic pathways

2.2.4對輔酶I含量和ATP酶活性的影響

由圖4可以看出,在用生防菌株發酵液提取物處理的初始階段,處理組的輔酶I含量略高于對照組;隨著處理時間的延長,處理組輔酶I含量不斷降低并趨于0,而對照組輔酶I的含量不斷增加。兩個生防菌株間的差異不顯著。結果說明,在病原菌菌體內以NAD為輔酶的脫氫酶將不能正常完成氫質子的傳遞,代謝活動將會出現紊亂。

圖3　生防菌株對病原菌TCA循環中關鍵酶活力的影響 Fig.3　Effects of the bio-control strains on pathogen’s key enzymes activities in TCA cycle

圖4　生防菌株對病原菌輔酶I含量的影響Fig.4　Effects of the biocontrol strains on the content of pathogen’s coenzyme I

由圖5可知,對照組的Na+,K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性從試驗開始至48 h內一直呈平穩上升趨勢,在48 h時基本達到最高值。而生防菌株發酵液提取物處理組的Na+, K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性呈先緩慢上升后急劇下降趨勢。提取物處理組酶活性在8 h或10 h時達到峰值,此時處理組的酶活性略高于對照組。在處理組酶活性達到最高值后的試驗時間內,3種ATP酶活性受到提取物的脅迫作用急劇下降,這勢必會使病原菌細胞內的能量供給出現不足,從而影響病原菌正常的生理活動。

圖5　生防菌株對病原菌ATP酶活力的影響 Fig.5　Effects of the biocontrol strains on ATP enzyme activities

2.3生防菌株對病原菌生理生化指標的影響

楊樹潰瘍病菌經提取物處理后,電導率隨著處理時間的增加而明顯增加(圖6)。說明病原菌的電解質外滲量增多,菌體膜的完整性遭到很大程度的破壞。

圖6　生防菌株對病原菌電導率的影響Fig.6　Effects of the biocontrol strains on pathogen’s conductivity

楊樹潰瘍病菌菌絲團經YGF9和LX6F2正丁醇提取物處理后2 h 開始,處理組的丙二醛(MDA)含量上升速度顯著高于對照組,處理組 MDA 含量呈現先上升后下降的趨勢,8 h 時達到最高值,而后平緩下降,48 h時降到最低值(圖7),對照組MDA含量隨處理時間的延長而呈現平緩增加的趨勢。此結果說明,生防菌株發酵液提取物使病原菌菌絲體細胞膜嚴重過氧化,嚴重影響了病原菌細胞膜的正常功能。

圖7　生防菌株對病原菌丙二醛含量的影響Fig.7　Effects of the biocontrol strains on pathogen’s MDA contents

圖8　生防菌株對病原菌蛋白質含量的影響Fig.8　Effects of the biocontrol strains on pathogen’s protein contents

處理組的蛋白質含量呈現顯著的下降趨勢(圖8),而對照組蛋白質含量變化較為平穩,說明提取物抑制了病原菌菌絲體蛋白質的合成。

3　結論與討論

本文研究了生防菌株YGF9和LX6F2對楊樹潰瘍病病原菌的抑菌機理,取得以下主要結論：①2株生防菌株均可降低病原菌代謝系統中關鍵酶的活性,使得病原菌代謝無法正常進行;②生防菌株使病原菌的電導率和MDA增加,使蛋白質含量降低,從而破壞病原菌的生理生化過程。

3.1代謝系統酶活性

生防菌株能夠抑制病原菌的生長,必然是破壞了菌絲體正常的生理代謝途徑,抑制了代謝途徑中各種重要酶的活性。很多生防菌株可誘導寄主防御保護酶活性的升高或者抑制病原菌保護酶的活性。由于超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等作為生物體內抗氧化系統的組成部分,起到保護機體組織細胞免受氧化劑的損害,具有抗組織細胞發生膜脂過氧化作用[9]。在本研究中,SOD、CAT、POD和PPO 4種酶對生防菌株提取物均比較敏感,都呈現出先上升后下降的趨勢。這種變化趨勢表明,病原菌菌體在提取物的逆境脅迫下,前期細胞內的SOD、CAT、POD和PPO 4種保護酶互相協調一致,呈現上升趨勢,以此來發揮它們對菌體的保護作用,但后期由于氧自由基的增加、H2O2毒害作用增強、膜脂過氧化的加重、菌體的保護屏障遭到破壞,最終導致各種酶含量的降低或消失。柳鳳等[10]發現經過紅樹內生細菌RS261菌株培養液處理后,辣椒苗體內MDA含量和SOD、POD以及CAT的活性等均較僅接種疫霉病菌的處理低,但可顯著誘導辣椒體內PAL的活性。植物在抵御病原微生物侵染的過程中,抗性相關酶發揮了重要作用,其中就包括了酚類代謝系統中的多酚氧化酶[11]。PPO通過催化木質素及醌類化合物形成,構成保護性屏蔽而使細胞免受病菌的侵害,也可以通過形成醌類物質直接發揮抗病作用。高效木霉菌株T-43 發酵液的乙酸乙酯提取物對病原菌的主要保護酶SOD、POD、CAT和PPO影響作用顯著,提取物通過破壞病原菌的防護系統,抑制病原菌生長[12]。

3.2生理生化指標

很多植物的病原真菌細胞壁及細胞膜是真菌的保護屏障,當真菌遇到強抑菌劑而使細胞膜遭到破壞時,菌體的保護屏障被打破,使其內部電解質外泄至培養液中,進而使培養液的電導率上升。膜透性的增大是膜系統被破壞的表現之一,膜透性的大小可用電解質滲漏率即電導率的變化來衡量。因此,菌液電導率的變化反映了真菌細胞膜通透性的變化[13]。張慧茹等研究發現絞股藍內生真菌JY25發酵液可以使致病大腸桿菌的電導率增加,是細胞膜受到明顯破壞[14]。類似地,本研究中生防菌株YGF9和LX6F2使病原菌的電導率明顯增大,破壞了病原菌細胞膜,影響了細胞膜的屏障功能。MDA是膜脂過氧化的產物,其含量的大小是衡量膜脂過氧化程度一個非常重要的生理指標,反映了膜結構受害程度的大小[15]。本研究中,經生防菌株發酵液提取物處理后病原菌的MDA含量增大,說明MDA對細胞的毒害作用增強,細胞膜脂嚴重氧化,細胞膜完整性受到破壞。蛋白質是肌體重要的組成部分,它能緩解和調節肌體在脅迫條件下引起的傷害[16]。葡萄座腔菌在提取物的脅迫作用下蛋白質含量降低,說明蛋白質對細胞的支撐和保護作用減弱,使病原菌更易受到損傷。

本試驗僅研究了生防菌株對病原菌代謝系統中各種關鍵酶的影響,如要了解其深層次的作用機理,則需要對各種酶對應的基因表達與否和表達量進行探索研究。此外,本研究的切入點是生防菌株對病原菌的影響,而對于生防菌株對寄主抗性誘導方面的研究以及寄主-病原菌-生防菌株三者的交互作用還沒有涉及,以后可以從這些方面進行深入研究。

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(責任編輯：田喆)

Antifungal mechanism of two biocontrol strains on poplar canker

Yang Lei1,2,Zhou Guoying1,Liang Jun1,2

(1. Key Laboratory of Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education, Central South University of Forestry & Technology, Changsha410004, China; 2. Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration, Research Institute of Forest Ecological Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing100091, China)

Trichodermaaureoviridestrain YGF9 andFusariumequisetistrain LX6F2 were two biocontrol strains which were respectively isolated from poplar tissues and soils. In order to explore the mechanisms of these strains in preventing disease, their biocontrol efficacies to poplar canker caused byBotryosphaeriadothidea, their disturbance to the pathogen’s metabolic pathways and influence on the pathogen’s physiological function were investigated. It showed that the N-butanol extract from the fermented liquids of strains YGF9 and LX6F2 could reduce the activities of SOD, CAT, POD, PPO, HK, PK, LDH, MDH, SDH and coenzyme Ⅰ, and caused the enzyme activities of Na+, K+-ATP, Mg2+-ATP and Ca2+-ATP enzyme to decline sharply. The two strains were able to increase the electrical conductivity and MDA content of the pathogen significantly, and reduce the protein content of the pathogen. In addition, it was found that the two biocontrol strains could destroy the metabolic pathways and affect the physiological function of the pathogen, which might be the reasons why the strains YGF9 and LX6F2 could prevent poplar canker.

poplar canker;Trichodermaaureoviride;Fusariumequiseti;biocontrol strain;antifungal mechanism

2015-04-15

2015-05-15

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD19B08)；湖南省研究生科研創新項目(CX2014B328)

E-mail:liangjun@caf.ac.cn

S 476.1,S 763.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.008