假蒟提取物殺蟲活性成分穩定性研究

呂美萍,　林　江*,　符悅冠,　張方平,　韓冬銀,　黃武仁

(1. 海南大學應用科技學院儋州校區,儋州　571737; 2. 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所,農業部熱帶農林有害生物入侵監測與控制重點開放實驗室,海南省熱帶農業有害生物檢測監控重點實驗室,儋州　571737)

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假蒟提取物殺蟲活性成分穩定性研究

呂美萍1,林江1*,符悅冠2,張方平2,韓冬銀2,黃武仁2

(1. 海南大學應用科技學院儋州校區,儋州571737; 2. 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所,農業部熱帶農林有害生物入侵監測與控制重點開放實驗室,海南省熱帶農業有害生物檢測監控重點實驗室,儋州571737)

采用常規浸提法對假蒟植株根莖部分進行提取,以提取物中殺蟲成分對斜紋夜蛾3齡幼蟲的活性作為評價指標, 綜合評價了不同pH、不同溫度和光照環境對假蒟提取物殺蟲活性成分穩定性的影響。結果表明,不同pH環境對假蒟提取物殺蟲活性成分影響不大;在高溫環境中,其活性有所下降；在不同光源處理中,影響較為嚴重的是太陽光,經照射處理72 h后,殺蟲活性效果由93.33%變為27.78%。在此基礎上,評價了11種常用光穩定劑的光分解抑制效果,結果發現,所評價的光穩定劑均具有一定抑制效果,其中以光穩定劑622和抗氧化劑TBHQ抑制效果較為明顯。在此基礎上,進一步評價了不同濃度622和TBHQ抑制效應差異,結果顯示抑制效果與濃度相關,濃度越高,抑制效果越明顯。

假蒟;提取物;穩定性;光分解抑制

假蒟(PipersarmentosumRoxb.)為胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)藤本植物,國外主要分布于印度、馬來西亞等熱帶地區,我國廣泛分布于南方熱帶地區[1]。自覃偉權等研究表明假蒟揮發油對小菜蛾具有良好的生物活性以來[2],假蒟植株乙醇提取物不斷被報道對多種蔬菜害蟲、害螨以及香蕉炭疽病、芒果炭疽病、香蕉枯萎病等多種病害具有較好生物活性[3-7]。隨著假蒟農用活性的逐漸開發利用,已有研究表明,假蒟提取物中的活性成分在使用時穩定性較差,尤其在田間使用時活性喪失更為明顯[8]。自然界是一個極為復雜的生態環境,物質在環境中的分解受多種因素影響。但是有關假蒟提取物中殺蟲活性成分的穩定性尚未見相關系統報道。本研究在前人進行活性研究的基礎上,以斜紋夜蛾3齡幼蟲為指示昆蟲,采用活體生物測定方法分別研究了不同環境條件下假蒟提取物中殺蟲活性成分的穩定性,利用假蒟提取物的殺蟲活性成分與斜紋夜蛾幼蟲生物活性之間的變化差異,以期闡明不同環境條件對假蒟提取物穩定性的影響,為假蒟植物的農用活性進一步開發利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

植物材料:假蒟(Pipersarmentosum),露天生長于中國熱帶農業科學院試驗場人工橡膠林林間,采集時間為2010年9月,采集部位為根莖。

供試昆蟲:斜紋夜蛾[Prodenialitura(Fabricius)]由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所昆蟲多樣性與生物防治課題組連續飼養2代后種群。

光穩定劑:紫外線吸收劑UV-531、UV-9;抗氧化劑264、1076、168、1010、DLTP、BHA、TBHQ;光穩定劑622、944；均由南京華立明科工貿有限公司提供,所有含量均≥98%。其他試劑均為分析純,市售。

1.2方法

1.2.1假蒟殺蟲活性物質的提取

采集新鮮假蒟植株去掉葉片后用清水洗去雜質,于避光條件下陰干,用固體粉碎機粉碎后密封保存備用。將95%工業乙醇與假蒟粉按重量比10∶1在廣口玻璃罐內浸提15 d,用旋轉蒸發器將乙醇浸提液減壓旋轉蒸發濃縮至膏狀物,濃縮膏狀物用適量去離子水稀釋后用石油醚進行萃取(石油醚萃取層變為無色為止),收集石油醚萃取液用旋轉蒸發器減壓濃縮至膏狀物后放入4 ℃冰箱中避光保存備用(因石油醚萃取組分為混合成分,以下試驗中均稱作“假蒟石油醚萃取物”)。

1.2.2假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾的毒力測定

稱取假蒟石油醚萃取物1 g,取2 mL丙酮進行溶解,滴加2～3滴T-80混勻后,根據預試驗結果用蒸餾水分別配制10.00、8.00、5.00、3.00、2.00、1.00 mg/mL 6個濃度。試驗采用浸蟲法進行處理[9],處理時將發育一致的斜紋夜蛾各齡期幼蟲用各供試濃度浸蟲5 s,處理后用紙巾輕吸去蟲體表面多余藥液,置于培養皿內(d=90 mm),用未經處理的蓖麻葉正常飼養于人工氣候箱中,飼養條件為L∥D=14 h∥10 h,T=(26±2) ℃,RH=75%±5%,以溶劑丙酮處理為對照,每個處理30頭蟲,設3次重復。24 h后檢查死亡情況,以用毛筆輕碰蟲體無任何反應視為死亡。

1.2.3不同pH條件對假蒟石油醚萃取物殺蟲活性的影響

稱取假蒟石油醚萃取物7管(每管20 g),用NaOH或HCl分別將其pH調為2、4、6、8、10、12等6個梯度后置于4 ℃冰箱中避光放置處理。分別于放置0、1、2、3、5、7、10 d后各取樣1 g,采用1.2.2中處理方式和對斜紋夜蛾3齡幼蟲的LC90值(5.00 mg/mL)為處理濃度進行處理,根據斜紋夜蛾3齡幼蟲處理24 h死亡率的變化情況評價不同pH環境條件對假蒟石油醚萃取物殺蟲活性的影響。以未做任何處理,正常避光存放于4 ℃冰箱中的假蒟石油醚萃取物處理斜紋夜蛾3齡幼蟲為對照,根據死亡率變化情況評價不同pH環境處理不同時間后對殺蟲活性物質穩定性的影響。

1.2.4不同溫度條件對假蒟石油醚萃取物殺蟲活性的影響

稱取假蒟石油醚萃取物8管(每管20 g),分別置于-20、-10、0、10、25、40、60 ℃等7個不同溫度下避光放置處理。分別于放置處理0、1、2、3、5、7、10 d后各取樣1 g,采用活體生測法對假蒟石油醚萃取物中殺蟲活性成分在不同溫度環境下的穩定性進行綜合評價。具體評價方法同1.2.3,以未作任何處理,正常避光存放于4 ℃冰箱中的假蒟石油醚萃取物處理斜紋夜蛾3齡幼蟲為對照。

1.2.5不同光照環境條件對假蒟石油醚萃取物殺蟲活性的影響

精確稱取假蒟石油醚萃取物8份(每份20 g)于培養皿中,用保鮮膜封口后分別置于實驗室自然光、太陽光(試驗時間為8月-9月,地點為實驗室陽臺,每天照射處理時間為8:00-18:00,其余時間均密封置于4 ℃冰箱中避光存放)、日光燈(40 W)、白熾燈(100 W)、紫外燈(25 W)、黑暗無光照等6個不同光源環境下進行照射處理,分別于照射處理0、1、2、3、5、7、12、24、48、72、96、144、168、192、216 h后各取樣1 g,采用活體生測法對假蒟石油醚萃取物中殺蟲活性成分在不同光照環境中的穩定性進行綜合評價。具體評價方法同1.2.3,以未作任何照射處理,正常避光存放于4 ℃冰箱中的假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾3齡幼蟲的處理為對照。

1.2.6不同光分解抑制劑對假蒟石油醚萃取物殺蟲活性成分光分解抑制作用研究

1.2.6.1光分解抑制劑溶液的配制

光分解抑制劑溶液配制,參照吳傳萬等[10]的光穩定劑標準溶液配制方法進行。配制時稱取光分解抑制劑0.5 g,量取5 mL甲苯將其溶解為100.00 mg/mL濃度,溶液置于棕色瓶中于4 ℃條件下避光保存備用。

1.2.6.2不同光分解抑制劑對假蒟石油醚萃取物殺蟲活性成分光分解抑制評價

精確稱取假蒟石油醚萃取物14份(每份10 g)于培養皿中,分別加入10 mL丙酮和1 mL光分解抑制劑溶液,充分混勻后用保鮮膜封口進行太陽光照射處理(處理方式及環境同1.2.5)。分別于照射處理12、24、48、72、96、144、192、216 h后取樣1 g,采用活體生測法綜合評價各種光分解抑制劑對假蒟石油醚萃取物中殺蟲活性成分的光分解抑制效果,具體評價方法同1.2.3。以正常避光存放于4 ℃冰箱和未添加光分解抑制劑直接進行太陽光照射處理的假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾3齡幼蟲的處理為對照。

1.2.6.3不同濃度TBHQ和光穩定劑622對假蒟石油醚萃取物殺蟲活性成分光分解抑制評價

精確稱取假蒟石油醚萃取物8份(每份10 g)于培養皿中,分別加入配制的TBHQ和光穩定劑622溶液各0.5、1.0、2.0 mL,充分搖勻后用保鮮膜封口進行太陽光照射處理(處理方式及環境同1.2.5)。分別于照射處理12、24、48、72、96、144、192、216 h后取樣1 g,采用活體生測法評價不同濃度TBHQ和光穩定劑622對假蒟石油醚萃取物中殺蟲活性成分的光分解抑制效果。具體評價方法同1.2.3,以未作任何相應處理,正常避光存放于4 ℃冰箱中和未添加光分解抑制劑直接進行太陽光照射處理的假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾3齡幼蟲的處理為對照。

1.3數據統計分析

用EXCEL統計軟件分析計算死亡率,采用SPSS13.0軟件進行顯著性檢驗、計算毒力回歸方程、LC50值、LC90值、擬合假蒟石油醚萃取物受光照處理后殺蟲活性變化方程、對應曲線并進行擬合卡方檢驗。

2　結果與分析

2.1假蒟石油醚萃取物對不同齡期斜紋夜蛾的活性

采用浸蟲法測定了假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾各齡期幼蟲24 h的毒力回歸方程,如表1所示。結果表明,假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾各齡期幼蟲均具有良好活性,對2、3、4、5、6齡幼蟲LC50值分別為1.398、2.175、3.279、10.434、12.816 mg/mL;LC90值分別為3.779、4.937、6.421、23.963、41.824 mg/mL。通過對不同齡期所測定的LC50、LC90值95%置信區間進行比較分析,可以看出,斜紋夜蛾幼蟲蟲齡大小明顯影響假蒟石油醚萃取物活性效果,隨齡期的增加,假蒟石油醚萃取物活性下降。

2.2不同pH和不同溫度對假蒟石油醚萃取物穩定性的影響

經不同pH和溫度環境對假蒟石油醚萃取物進行處理不同時間后,其活性變化情況如圖1、圖2所示,假蒟石油醚萃取物殺蟲活性成分在不同pH環境下的活性相對穩定,經不同pH環境處理10 d后假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾3齡幼蟲的致死率與對照相比,無明顯差異。在不同溫度環境中,假蒟石油醚萃取物殺蟲活性成分在低溫處理和常溫環境下相對穩定,但隨著溫度的升高和處理時間的延長,在60 ℃高溫條件下處理10 d后,對斜紋夜蛾的生物活性由90%下降到70%。

2.3光照對假蒟石油醚萃取物穩定性的影響

不同光照環境對假蒟石油醚萃取物連續處理不同時間后,結果如圖3所示,經太陽光、紫外燈和日光燈處理12 h后,萃取物對斜紋夜蛾的活性開始降低,120 h后對斜紋夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性極顯著低于室內自然光、節能燈和黑暗。與12 h時相對比,太陽光、紫外燈和日光燈處理中試蟲死亡率分別由80.00%、85.56%和88.89%降低為1.11%、11.11%和21.11%,而黑暗處理、節能燈、室內自然光和對照處理中試蟲的死亡率則分別由91.11%、90.00%、88.89%、92.22%變為90.00%、90.00%、81.11%、91.11%。在致死率與光照時間的動態關系中,假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性隨光照處理時間的增加呈指數型下降。且太陽光照射處理影響明顯大于紫外燈和日光燈。在3種不同光源照射處理中,太陽光處理12 h后致死率明顯下降, 72 h基本失活,而經紫外燈和日光燈處理后,影響相對略低,活性在處理48 h后才開始逐步下降。由此表明在不同光源的處理中,太陽光、紫外燈和日光燈對假蒟提取物的殺蟲活性影響極大,而在黑暗、室內自然光和節能燈光下其活性變化不大,相對穩定。這一結果表明,光照是限制假蒟提取物殺蟲活性成分穩定的一個重要因素。

表1　假蒟石油醚萃取物對斜紋夜蛾不同齡期幼蟲的毒力測定結果Table 1　Toxicity tests of Piper sarmentosum petroleum ether extract to different instar larvae of Prodenia litura

圖1　不同pH環境下假蒟石油醚萃取物殺蟲 活性隨時間變化情況Fig.1　Changes in the insecticidal activity of Piper sarmentosum petroleum ether extract over time under different pH values

圖2　不同溫度環境下假蒟石油醚萃取物殺蟲 活性隨時間變化情況Fig.2　Changes in the insecticidal activity of Piper sarmentosum petroleum ether extract over time under different temperatures

圖3　不同光照環境下假蒟粗提物殺蟲活性隨時間變化情況Fig.3　Changes in the insecticidal activity of Piper sarmentosum petroleum ether extract over time under different illuminations

照射光源Illuminationsource衰減方程Attenuationequation相關系數r半衰期hHalf-life卡方值χ2幾率值PF值太陽光SunlightC=102.309e-0.0214t0.97132.388.5990.800431.977紫外燈UltravioletC=97.377e-0.0095t0.99072.955.8200.9711331.648日光燈FluorescentlampC=93.965e-0.0079t0.96787.725.3890.979382.601

根據農藥光致活性降低反應可按一級動力學反應來描述的原理,對假蒟殺蟲活性成分的光降解反應描述方程式為:

Ct=C0e-kt

公式中:k為活性下降速率常數;Ct為t時刻的斜紋夜蛾的平均死亡蟲數;C0為斜紋夜蛾的理論初始平均死亡蟲數。

根據化合物受光照后的活性衰減動態,用一級動力學模型進行擬合,結果如表2所示,擬合方程經卡方(χ2)檢驗發現,假蒟石油醚萃取物在太陽光、紫外燈和日光燈照射處理后活性的衰減過程符合一級動力學模型,三者的幾率值分別為0.800、0.971、0.979,根據方程計算,假蒟石油醚萃取物殺蟲活性成分經太陽光照射處理后的半衰期為32.38 h,明顯

短于紫外燈的72.95 h和日光燈的87.72 h,而衰減常數,太陽光處理的0.021 4明顯大于紫外燈的0.009 5和日光燈的0.007 9。

2.4光穩定劑對假蒟殺蟲活性物質光分解的抑制作用

不同光穩定劑對假蒟殺蟲活性成分光分解的抑制作用如表3所示。結果表明11種光穩定劑對假蒟殺蟲活性成分的光分解均具有一定抑制作用,尤其以光穩定劑622和抗氧化劑TBHQ的抑制作用為最強,相比較在所選的光穩定劑中,紫外線吸收劑的抑制效果相對較弱,明顯低于抗氧化類光穩定劑。在所處理的假蒟石油醚萃取物中加入光穩定劑622和抗氧化劑TBHQ后,在太陽光下照射216 h后其活性仍能保持在50%以上,而未加光穩定劑的空白對照在處理144 h已經基本喪失活性(致死率低于5%)。

表3　太陽光照射下不同種類光分解抑制劑對假蒟殺蟲活性成分光分解的抑制作用1)Table 3　Inhibition effects of different photolysis inhibitors on the photolysis of active ingredients in thePiper sarmentosum petroleum ether extract under sunlight

1) 數據后不同字母表示差異顯著, 采用Duncan 氏新復極差法,P<0.05, 下同。

Different letters indicate significant difference by Duncan’s multiple range test (P<0.05). The same below.

2.5不同濃度光穩定劑對假蒟殺蟲活性光分解的抑制作用

不同濃度光穩定劑622和TBHQ對假蒟石油醚萃取物進行處理后,測定結果如表4所示。不同濃度光穩定劑622和TBHQ對假蒟提取殺蟲活性成分的光分解均具有強烈抑制作用(P<0.05),其抑制效果與濃度具有一定相關性,處理濃度越大,對假蒟殺蟲活性成分的光分解抑制作用效果越強。

表4　不同濃度光穩定劑622和TBHQ對假蒟石油醚萃取物在太陽光下光分解的抑制作用Table 4　Inhibition effects of different doses of antioxidant TBHQ and light stabilizer 622 on the photolysis ofPiper sarmentosum petroleum ether extract under sunlight

3　結論與討論

對假蒟石油醚萃取物進行活性測定結果表明,假蒟根莖石油醚組分具有良好的殺蟲活性,尤其對斜紋夜蛾幼蟲活性極為顯著,該結果與劉紅芳等[11]及劉剛[12]的研究基本一致。在植物源農藥穩定性研究中,大量試驗表明魚藤酮、苦參堿、印楝素等多種天然產物成分都有見光易分解情況,且在太陽光和紫外光照射下半衰期均極短[13-15]。對于假蒟提取物中的殺蟲活性成分在實際生產應用中對光照敏感的相關報道較多,尤其在低濃度下使用時,受光分解導致活性較低現象最為顯著,劉紅芳對0.50%和0.25%兩個濃度假蒟提取物用太陽光照射處理2 d后,其對斜紋夜蛾的觸殺活性分別下降為原來的50%和20%[16]。本研究結果表明：假蒟石油醚萃取物的殺蟲活性物質在不同pH的酸堿環境中具有良好的穩定性；高溫會影響其活性,在60 ℃高溫環境中連續放置10 d后,對斜紋夜蛾的致死率由90%下降到70%,其活性降低了22%。這與徐文靜等研究的大蒜提取液對高溫、堿性、過酸等條件影響觸殺效果的研究結果基本一致[17]。假蒟乙醇初提物經石油醚萃取之后的殺蟲活性物質對太陽光、紫外光和日光燈極為敏感。相關天然產物光穩定性研究報道,許多植物成分經太陽光、紫外光和日光燈照射處理后都容易分解,除蟲菊素經日光燈照射處理后,半衰期降為4.9 d,而阿維菌素僅為3 h左右[18-19]。根據化合物受光照后的活性衰減動態,用一級動力學模型進行擬合表明,假蒟提取物中殺蟲活性物質在太陽光、紫外光和日光燈照射下的衰減過程符合一級動力學模型。在3種光照下的光半衰期分別為32.38、72.95 h和87.72 h。

增強活性物質在光照環境中的穩定性,延長其半衰期是目前對天然產物研究的關注點,大量研究表明,通過在制劑中加入紫外光屏蔽物質和抗氧化劑可一定程度上改善光敏物質的光不穩定性[20-21]。本研究利用生物測定法,在探明不同光照環境對假蒟殺蟲活性影響的基礎之上,對生產上常用的光穩定劑進行光分解抑制效果評價,結果表明光穩定劑622和氧化抑制劑TBHQ對假蒟殺蟲活性物質的光分解具有良好抑制效果,經光穩定劑處理之后,在太陽光下照射216 h后的分解抑制率達50%以上,且抑制效果的強弱,與光穩定使用濃度呈正相關性。這一研究結果對假蒟用于生產中控制有害生物發生具有重要意義。但是由于本試驗所使用的假蒟殺蟲活性物質為石油醚萃取的混合物質,且只采用了活體生物測定法進行評價,具體光照是對假蒟殺蟲活性物質的哪個成分產生影響,發生何種反應,還需通過進一步對有效成分含量變化及降解物的分析等研究來獲得更多信息。從開發利用的角度來看,假蒟提取物的殺蟲活性物質抗光解劑的篩選和相關機理值得深入研究。

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(責任編輯：田喆)

Stability of the insecticidal active constituents of the extract fromPipersarmentosum

Lü Meiping1,Lin Jiang1,Fu Yueguan2,Zhang Fangping2,Han Dongyin2,Huang Wuren2

(1. College of Applied Science and Technology, Hainan University Danzhou Campus, Danzhou571737,China;2. Institute of Environmental and Plant Protection, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences; Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasion Alien Pests,Ministry of Agriculture; Key Laboratory of Tropical Agricultural Pests Detection and Control,Hainan Province, Danzhou571737, China)

Based on the effect of its components onProdenialitura(Fabricius) 3rd instar larvae, the rhizomes ofPipersarmentosumRoxb. were extracted by using a conventional extraction approach, and the effects of different pH values, temperatures and light environments on the stability of the active components of its extractives were comprehensively evaluated. The results showed that the active components ofP.sarmentosumwere relatively stable at different pH values, and their activity had little change, but the activity declined with rising temperature; in the tests with different light sources, the activity was significantly influenced by sunlight; under the condition of sunlight for 72 h, its effect changed from 93.33% to 27.78%. Subsequently, we used 11 different light stabilizers to examine the inhibitory effect of photolysis, finding that different stabilizers all had some inhibitory effect, and that light stabilizer 622 and TBHQ were obviously effective. We also evaluated the effects of the light stabilizer 622 and TBHQ with different concentrations on the inhibition ofP.sarmentosum, finding that the inhibitory effect was correlated with the concentration: the higher the concentration, the more obvious the inhibitory effect.

Pipersarmentosum;extract;stability;photolysis inhibition

2015-01-05

2015-04-05

海南大學應用科技學院基金項目(Hyk-1307)

E-mail:linjiang19870417@163.com

S 482.39

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.009