國外引進甘蔗材料白葉病植原體巢式PCR檢測及其序列分析

王曉燕,　李文鳳,　黃應昆,　張榮躍,　單紅麗

(云南省農業科學院甘蔗研究所,云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室, 開遠　661699)

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國外引進甘蔗材料白葉病植原體巢式PCR檢測及其序列分析

王曉燕,李文鳳,黃應昆*,張榮躍,單紅麗

(云南省農業科學院甘蔗研究所,云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室, 開遠661699)

為有效防止引起重要危險性檢疫病害甘蔗白葉病(SCWL)的植原體病原隨引進甘蔗材料侵入我國,確保我國甘蔗生產安全,本研究對從緬甸、菲律賓、法國和泰國引進的22個甘蔗材料進行了SCWL植原體巢式PCR檢測,并對陽性樣品的巢式PCR產物進行了測序及序列分析。結果表明,18個甘蔗材料呈SCWL植原體陽性,陽性檢出率為81.8%。所有SCWL陽性樣品的16S-23S 基因間隔區片段長210 bp,與GenBank中已有的其他SCWL植原體分離物(登錄號HQ917068、AB646271)的同源性為99.8%～100%,并在系統發育樹中聚為一個類群。根據SCWL的巢氏PCR檢測及其序列分析結果,對呈陽性的材料及時進行了集中銷毀處理。

國外甘蔗材料;甘蔗白葉病;巢式PCR檢測;序列分析

甘蔗白葉病(sugarcane white leaf, SCWL)是由植原體引起的甘蔗重要病害之一[1-5]。該病于1954年首先在泰國北部南邦府發生[6],現已廣泛發生于印度、斯里蘭卡、日本、緬甸、菲律賓、老撾和越南等亞洲國家[7-13];我國臺灣于1958年報道了該病的發生[14]。SCWL對甘蔗的危害是毀滅性的,在泰國SCWL發病率達5%～35%,每年導致超過2 000萬美元的損失[4]。在新幾內亞,該病害造成栽培品種‘拉格納’損失高達100%[7,15],給當地甘蔗和制糖產業造成了巨大的經濟損失。

SCWL植原體存在于病株韌皮部篩管中,甘蔗是無性繁殖作物[16],SCWL可通過帶病蔗種進行遠距離傳播,且傳播性極強,是重要的檢疫對象。近年來,云南省農業科學院甘蔗研究所結合云南省建設面向西南開放橋頭堡的發展戰略,深入開展與東南亞國家在甘蔗科技方面的合作交流,每年都從緬甸、菲律賓、泰國等東南亞國家引進甘蔗品種和資源材料。為了防止危險性檢疫病害SCWL隨引進的甘蔗材料侵入我國境內并擴散蔓延,對甘蔗生產造成嚴重威脅,筆者利用已建立的巢式PCR技術對從國外引進的甘蔗材料進行了SCWL植原體檢測,同時對SCWL陽性樣品的16S-23S基因間隔區序列(16S-23S ISR)進行了克隆和同源性分析。

1　材料與方法

1.1材料

從緬甸引進的7個甘蔗材料k95-205、k95-282、k95-89、k91-2-056、k95-87、01-89、09-02;從菲律賓引進的4個甘蔗材料PSR03-48、PSR03-128、PSR03-147、PSR02-237;從法國引進的7個甘蔗材料DB71060、CP99-1534、CP99-1894、CP00-1101、CP00-1252、Ho95-988、PSR97-092;從泰國引進的4個甘蔗材料KK3、UT6、SP50、SP72。陽性對照為感染SCWL的甘蔗材料UT3的葉片總基因組DNA,由云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室提供,陰性對照為健康甘蔗葉片基因組DNA,空白對照為滅菌雙蒸水。

1.2巢式PCR檢測

1.2.1引物序列

擴增SCWL植原體16S rDNA的引物序列參照文獻[2,5,17],委托上海生工生物工程公司合成。MLOX:5′-GTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAGC-3′,MLOY:5′-GTGCCAAGGCATCCACTGTATGCC-3′;P1: 5′-GTCGTAACAAGGTATCCCTACCGG-3′,P2:5′-GGTGGGCCTAAATGGACTTGAACC-3′。預期擴增產物長度為210 bp。

1.2.2樣品DNA的提取

參照Harrison等[18]的方法,改進后提取葉片基因組DNA。稱取0.2 g甘蔗樣品葉組織,加入液氮研磨成粉并轉入2.0 mL離心管,加入1 mL 經65℃預熱的CTAB抽提緩沖液,65℃水浴30 min,12 000 r/min離心10 min;取上清液加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)搖勻,12 000 r/min離心10 min;取750 μL上清液加入2/3體積異丙醇,緩慢翻轉混勻,于-20℃放置4 h,12 000 r/min離心10 min;沉淀用500 μL 95%乙醇清洗2次,12 000 r/min離心5 min;室溫下干燥1.5 h;加入180 μL滅菌雙蒸水,室溫放置1.5 h,充分混勻;加入200 μL 5 mmol/L NaCl和200 μL 95%乙醇,混勻,12 000 r/min離心5 min;沉淀加入500 μL 70%乙醇,12 000 r/min離心5 min;沉淀于室溫下風干,溶于40 μL滅菌雙蒸水中,置于-20℃保存備用。

1.2.3植原體的巢式PCR檢測

參考盧文潔等[19]建立的SCWL植原體巢式PCR檢測體系,對待測樣品進行檢測。以待測樣品DNA為模板,MLOX/MLOY為第1次PCR引物,反應體系為20 μL:10×PCR buffer 2.5 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,25 mmol/L MgCl20.5 μL,5 U/μLTaq酶0.2 μL,20 μmol/L MLOX和MLOY 各1 μL,模板總基因組DNA 1 μL,ddH2O 13.8 μL。擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,25個循環;最后72℃延伸10 min。取1 μL第1次PCR擴增產物,稀釋100倍作為模板,P1/P2為引物,進行巢氏PCR擴增。巢氏PCR反應體系為20 μL: 20 μmol/L P1和P2各1 μL,其他試劑用量同第1次PCR擴增。第2次PCR擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,62℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環;最后72℃延伸10 min。

取10 μL 巢式PCR產物經2%瓊脂糖凝膠(膠里預先加入0.005%的GoldView核酸染料),在0.5×TBE緩沖液，100 V的電壓下電泳40 min后,用Bio-Rad凝膠成像系統觀察,擴增到210 bp條帶的為陽性,反之為陰性。

1.2.4巢式PCR產物克隆、測序及序列分析

陽性巢式PCR產物用快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒(天根生化科技公司)純化。純化后的PCR產物與克隆載體pMD18-T(TaKaRa公司)于16℃下過夜連接,連接產物轉化大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞,涂布于含Amp的LB固體培養基,于37℃培養箱中倒置培養。挑取平板上的單克隆菌落于LB液體培養基中振蕩培養,取適量的培養產物用于PCR檢測。每個分離物挑選6個經PCR鑒定為陽性的克隆,送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序。將所測序列提交GenBank并進行BLAST比對檢索,與NCBI上已知序列進行同源性比較,采用DNAMAN 6.0和MEGA 4.0軟件進行序列分析并構建系統進化樹。

2　結果與分析

2.1SCWL植原體巢式PCR檢測

利用巢式PCR技術對從緬甸、菲律賓、法國和泰國引進的22個甘蔗材料進行檢測,結果顯示:從緬甸引進的5個材料 k95-282、k91-2-056、k95-87、01-89、09-02,從菲律賓引進的3個材料PSR03-48、PSR03-128、PSR02-237,從法國引進的6個材料CP99-1534、CP99-1894、CP00-1101、CP00-1252、Ho95-988、PSR97-092,和從泰國引進的4個材料 KK3、UT6、SP50和SP72 等共18個材料都擴增出約210 bp的目的片段,陽性檢出率為81.8%。從緬甸引進的k95-205、k95-89,從菲律賓引進的PSR03-147和從法國引進的DB71060等4個材料未出現特異性擴增條帶。圖1為部分檢測樣品的電泳結果。

圖1　部分國外引進甘蔗品種材料SCWL巢式PCR檢測結果Fig.1　Nested PCR detection result of SCWL in some exotic sugarcane materials

2.2巢式PCR擴增產物測序結果及序列分析

對18個SCWL陽性樣品的巢式PCR產物進行回收、克隆、測序。結果表明,來源于緬甸、菲律賓、法國和泰國的18個SCWL樣品的16S-23S ISR序列長度都為210 bp。從每個國家的供試樣品中隨機選擇1個樣品序列提交到GenBank,序列號分別為KC662511(緬甸k95-282)、KC662512(菲律賓PSR03-48)、KC662510(法國CP99-1534)和KF431838(泰國UT6)。經NCBI BLAST比對發現,緬甸‘k95-282’、菲律賓‘PSR03-48’、法國‘CP99-1534’和泰國‘UT6’SCWL分離物16S-23S ISR核苷酸序列與GenBank中公布的泰國和緬甸SCWL植原體分離物(登錄號HQ917068、AB646271)相應序列同源性高達99.8%～100%,而與其他組植原體相應序列的同源性低于89.9%。表明檢測的片段是甘蔗白葉病植原體。

2.3系統進化樹構建與分析

將GenBank中植原體16Sr各組代表性16S-23S ISR序列下載下來,與本研究測定的4個SCWL 16S-23S ISR序列進一步進行同源性分析,利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹,以Acholeplasmalaidlawii(登錄號JQ390342)為外群(圖2)。由系統發育樹可以看出,緬甸、菲律賓、法國和泰國SCWL植原體分離物與GenBank中已有的SCWL植原體分離物(登錄號HQ917068、AB646271)歸為一個類群,都屬于16Sr Ⅺ組植原體。

圖2　基于16S-23S ISR序列的緬甸、菲律賓、法國和泰國甘蔗 白葉病植原體及其他相關植原體株系的系統進化發育樹Fig.2　Phylogenetic tree based on the 16S-23S ISR sequences of SCWL phytoplasma from Myanmar, the Philippines,France, Thailand and other representative phytoplasma

3　討論

隨著云南橋頭堡建設發展戰略的深入實施,與東南亞國家在甘蔗科技方面的合作交流加強,國際甘蔗種質資源引進交換工作不斷深入,引種國家數量增加,規模、范圍不斷擴大,由國外引種導致的病害侵入風險也在不斷增加。因此,切實加強甘蔗引種檢疫檢測工作將是有效防止外來危險性有害生物隨引種傳入我國蔗區造成災害隱患的首要任務和安全保障措施。

SCWL是甘蔗上分布廣泛,危害嚴重的重要病害[4,7],極大地威脅著甘蔗的生產和發展[15]。本研究利用已建立的巢式PCR技術,對從緬甸、菲律賓、法國和泰國引進的22個甘蔗材料進行了危險性檢疫病害SWCL的檢測,結果有18個甘蔗材料呈陽性,陽性檢出率為81.8%,其余呈陰性。本文所測SCWL陽性樣品的16S-23S ISR序列與其他GenBank中已公布的SCWL植原體分離物16S-23S ISR序列同源性高達99.8%～100%,且在系統發育樹中所有的SCWL植原體都歸為一個類群。進一步證實了18份國外引進甘蔗材料中存在SCWL植原體。根據巢氏PCR檢測及序列分析結果,對呈陽性的甘蔗材料及時進行了銷毀處理,為國際合作甘蔗材料交換的順利開展和實施提供了安全保障。本研究結果顯示從緬甸、菲律賓和泰國等東南亞國家引進的甘蔗材料SWCL陽性檢出率高,這與有關研究報道相吻合,SCWL近年在東南亞國家發生尤為普遍和嚴重,且SCWL易隨蔗種進行遠距離傳播。這就要求我們今后在加強與東南亞國家深入開展甘蔗科技交流合作,進行甘蔗材料交換工作中,要重點加強對引進甘蔗材料的SCWL檢疫檢測,有效防止其隨引進材料侵入我國境內擴散蔓延,確保我國蔗糖產業的安全可持續發展,推進國際合作的長遠發展。

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(責任編輯：楊明麗)

Nested PCR detection and sequence analysis of phytoplasma causing white leaf disease in imported sugarcane materials

Wang Xiaoyan,Li Wenfen,Huang Yingkun,Zhang Rongyue,Shan Hongli

(Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan661699, China)

To effectively prevent invasion of sugarcane white leaf disease (SCWL), an important quarantine disease caused by phytoplasma, into China through introduction of sugarcane materials, and to secure sugarcane production, phytoplasma causing SCWL was detected by nested PCR in 22 imported sugarcane materials from Myanmar, the Philippines, France and Thailand. Then, the nested PCR products of SCWL positive samples were sequenced and analyzed. The results showed that 18 of 22 materials (81.8%) were positive. The 16S-23S intergenic region of all SCWL positive samples were all 210 bp long, and shared 99.8% to 100% identity with other published SCWL phytoplasma sequences (GenBank accession number HQ917068, AB646271), and they were clustered together in a group in phylogenetic tree. Based on the nested PCR detection and sequence analysis results, the SCWL positive materials were destroyed immediately.

imported sugarcane materials;sugarcane white leaf disease;nested PCR detection;sequence analysis

2015-02-14

2015-04-22

國家現代農業產業技術體系(CARS-20-2-2)；云南省現代農業產業技術體系

E-mail:huangyk64@163.com

S 435.661, Q 939.34

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.025