新疆榆樹黃萎病病原菌鑒定

岳永亮,　任毓忠,　張　莉,　金恭璽,　李國英

(石河子大學農(nóng)學院, 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室, 石河子　832003)

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新疆榆樹黃萎病病原菌鑒定

岳永亮,任毓忠,張莉,金恭璽,李國英*

(石河子大學農(nóng)學院, 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室, 石河子832003)

2013年以來,在石河子大學農(nóng)學院試驗站榆樹苗上,出現(xiàn)了一種病害,可導致葉片褪綠,變黃,萎蔫,甚至枯死,剖莖檢查可見維管束變成褐色。采用常規(guī)組織分離法對病莖組織進行分離、純化獲得單孢純培養(yǎng)菌株;通過常規(guī)紙缽撕底蘸根法對其進行致病性測定;用形態(tài)學和rDNA-ITS序列分析方法對病原菌進行鑒定。結(jié)果表明,分離菌株的菌落形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)都與大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)一致;經(jīng)分子生物學鑒定,該菌的rDNA-ITS序列與中國棉花黃萎病菌(V.dahliae)的ITS序列(登錄號EU 835817.1)相似性達99.0%,故將引起新疆榆樹黃萎病的病原菌鑒定為大麗輪枝菌(V.dahliae)。

榆樹;黃萎病;病原鑒定

榆樹(UlmuspumilaL.)屬榆科,落葉喬木,主要分布在東北、華北、西北、華東等地。榆樹喜光,耐旱,耐寒,耐瘠薄,壽命長,適應性強。木材耐磨,耐腐,是造船、建筑、室內(nèi)裝修地板、家具的優(yōu)良用材。榆樹是我國西北重要的園林綠化樹種,廣泛用于道路兩側(cè)、庭院、公園、工廠等的綠化,也是減輕大氣污染物的重要途徑和手段[1]。2013—2014年在新疆石河子大學農(nóng)學院試驗站發(fā)現(xiàn)一種新的榆樹病害,一年生榆樹出苗后,在8—9月間葉片主要自下而上出現(xiàn)褪綠,變黃,萎蔫,有些葉脈間組織褪綠后發(fā)生枯死,葉片逐漸脫落,嚴重者出現(xiàn)頂枯。剖莖檢查可見維管束變褐色。為了搞清其病害種類,對其病原進行了鑒定。

1　材料與方法

1.1標本來源及癥狀描述

標本來源于2013年采自新疆石河子市石河子大學農(nóng)學院試驗站由種子萌發(fā)的榆樹幼苗病株。通過田間自然發(fā)病和人工接種發(fā)病植株進行癥狀描述。

1.2病原菌分離純化及致病性測定

2013年9月從田間選取榆樹幼苗發(fā)病莖桿,在無菌條件下,撕去皮層,將病莖維管束切成0.5 cm×0.5 cm的小塊,用75%乙醇表面消毒2 min,無菌水沖洗3次,置于PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng),待長出菌絲后,挑取菌落邊緣進行純化,純化后的菌落進行單孢分離培養(yǎng),然后4℃試管斜面保存和-70℃ 20%甘油孢子懸浮液保存,備用。病原菌的致病性測定參照馬存等[2]的紙缽撕底蘸根法進行接種。榆樹幼苗采用種子繁殖,55℃溫湯浸種24 h,播入裝有無菌土的直徑12 cm×12 cm的營養(yǎng)缽,置于25～30℃的溫室。當幼苗長到4片真葉時用孢子濃度1×107個/mL新鮮菌液15 mL接種榆樹苗根部,以接15 mL無菌水為對照,設(shè)3個重復。待植株發(fā)病后對病原菌進行再分離,對植株的發(fā)病情況進行詳細記載。

1.3形態(tài)學鑒定

將-70℃保存的病原菌在PDA培養(yǎng)基上活化7 d,在無菌操作下用滅菌的直徑為7 mm的打孔器在活化菌落邊緣打7 mm的菌餅,挑到新PDA平板的中央。分別置于10、15、20、25、30℃和35℃溫度下的6個光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),每2 d觀察記錄一次,16 d后結(jié)束。觀察病原菌在PDA平板上的菌落特征、微菌核產(chǎn)生情況、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)及大小,并進行顯微測量。

1.4分子生物學鑒定

1.4.1DNA提取

病原菌DNA的提取采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑盒進行提取。

1.4.2rDNA-ITS區(qū)的擴增及測序

采用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4擴增菌株rDNA-ITS區(qū)段。引物序列:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應體系25 μL,其中,引物ITS1(10 μmol/L)1 μL,引物ITS4(10 μmol/L)1 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL,模板DNA 1 μL,加ddH2O至25 μL。PCR擴增反應程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。取5 μL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外透射儀下檢測PCR產(chǎn)物大小,DNA marker為DL2000。擴增產(chǎn)物直接進行測序。

1.4.3rDNA-ITS序列比較分析

測序后序列經(jīng)校正后,在NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank中進行同源序列搜索,比較測試菌株與數(shù)據(jù)庫中相應序列的相似性。

2　結(jié)果與分析

2.1病害癥狀

榆樹在田間出苗后,該病害一般在9月份開始發(fā)病,病初癥狀常從葉片邊緣開始,葉脈間的組織出現(xiàn)褪綠、葉片自下而上黃化,嚴重者整株葉片變黃,頂端枯死,剖莖檢查維管束變成褐色,和棉花黃萎病的癥狀有些類似,但發(fā)病明顯比棉花黃萎病要晚,且以黃化枯死為主。室內(nèi)人工接種后,一般50 d后常從葉片邊緣開始,其葉脈間的葉肉發(fā)黃,葉片自下而上出現(xiàn)黃化,重者葉片逐漸干枯脫落,造成整株萎蔫。剖莖檢查病株維管束變褐色。接種癥狀和田間癥狀一致(圖1a、b、c)。

圖1　榆樹黃萎病癥狀Fig.1　Symptoms of Verticillium wilt in elm

2.2致病性

室內(nèi)接種植株表現(xiàn)出與大田發(fā)病植株相同的癥狀,未接種對照植株表現(xiàn)正常。從接種發(fā)病榆樹幼苗植株上進行再分離,分離到與接種菌株相同的病原菌。

2.3形態(tài)學鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 d后,菌落為近圓形。但在不同溫度下其菌落特征有一定區(qū)別。在10、15、20、25℃菌落邊緣光滑并有白色環(huán)帶,產(chǎn)生微菌核,有明顯或不明顯的放射狀褶皺,氣生菌絲白色或鼠灰色,不發(fā)達;在20℃時有明顯的同心輪紋;在25℃生長最快,20℃次之。在30℃不產(chǎn)生微菌核,菌落正面呈規(guī)則的放射狀乳白色,且菌絲較少,背面米黃色。35℃下不生長(圖2a)。普通顯微鏡觀察分生孢子梗無色透明,多由1～3層輪生小梗和一個頂枝組成,每層有3～4個分枝(圖2 b),頂枝小梗大小32.5 ～87.5 μm,平均49.3 μm;輪枝小梗大小17.5 ～40.0 μm,平均26.75 μm;輪層間距大小為30.0～67.5 μm,平均45.4 μm。分生孢子無色透明,橢圓形、卵形等,大小為(5.0～7.5)μm×(2.5～5.0)μm,平均6.0 μm×3.3 μm,濕度大時在小梗頂端聚集成假頭狀。微菌核念珠狀、橢圓形、長圓形或不規(guī)則形(圖2 c),大小差別很大,一般(30.0～100.0)μm×(22.5～50.0)μm,平均58.0 μm×34.0 μm。形態(tài)學鑒定與已報道的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)一致。

圖2　榆樹黃萎病病原菌的形態(tài)Fig.2　Morphology of the pathogen causing Verticillium wilt in elm

2.4分子生物學鑒定

使用通用引物ITS1和ITS4對病原菌rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增,可擴增出大小為496 bp的片段。將擴增產(chǎn)物測序所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中核苷酸數(shù)據(jù)進行BLAST比對分析,該序列與已報道的來自中國棉花的V.dahliae序列(登錄號 EU 835817.1)相似性達99.0%。

3　討論

2013—2014年對新疆石河子大學農(nóng)學院試驗站試驗田進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn),田間由榆樹種子萌發(fā)的幼苗在8、9月間常發(fā)生一種葉片褪綠,變黃,萎蔫,后期枯死的病害,剖莖檢查其維管束變成褐色。通過病原菌形態(tài)觀察、致病性測定和分子生物學鑒定,證明它們是由大麗輪枝菌(V.dahliae)引起的榆樹黃萎病。大麗輪枝菌是一種典型的土傳病害,具有寄主多、分布廣的特點,可危害38科660種植物,常引起多種植物黃萎病[3-4],但榆樹黃萎病病原鑒定未見報道。經(jīng)初步試驗,從榆樹幼苗病株中分離的這種大麗輪枝菌,還可侵染棉花、綠豆和紅花等。發(fā)現(xiàn)榆樹幼苗黃萎病的田間,其前茬是棉花黃萎病重病田。據(jù)報道,目前新疆棉花黃萎病發(fā)生較重[5-6],為此在棉花黃萎病重病田輪作倒茬時不要進行榆樹苗的繁殖,以免引起經(jīng)濟損失。有關(guān)榆樹幼苗黃萎病在新疆的發(fā)生情況和棉花黃萎病的關(guān)系及其防治等有待進一步研究。

[1]魯敏,姜鳳岐.綠化樹種對大氣 SO2、鉛復合污染反應[J]. 城市環(huán)境和城市生態(tài),2004,16(6):23-25.

[2]馬存.棉花枯萎病與黃萎病[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2007:61-106.

[3]Pegg G F,Brady B L.Verticilliumwilts [M].UK:CABI Publishing, 2002.

[4]Chen W. Vegetative compatibility groups ofVerticilliumdahliaefrom ornamental woody plants [J]. Phytopathology, 1994,84:214-219.

[5]韓宏偉,劉培源,吉麗麗,等.新疆北部棉區(qū)棉花黃萎病菌病原種群致病性分化及變異[J]. 植物保護學報,2011,38(2):121-126.

[6]韓宏偉,任毓忠,劉培源,等.新疆南部棉區(qū)黃萎病菌種群致病性分化及變異[J]. 棉花學報,2012,24(2):147-152.

(責任編輯：田喆)

Identification of the pathogen causingVerticilliumwilt onUlmuspumilain Xinjiang

Yue Yongliang,Ren Yuzhong,Zhang Li,Jin Gongxi,Li Guoying

(College of Agriculture, Shihezi University, Key Laboratory at Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricultural Pest Management and Plant Protection Resource Utilization, Shihezi832003, China)

Since 2013, symptoms of chlorosis, yellowing, and wilting were observed on the leaves of elm seedlings in a plantation at an experiment station near Shihezi University in Xinjiang Uygur Autonomous Region. Some of the seedlings eventually died. Vascular discoloration was observed when the infected plants were dissected. The pathogen was isolated from the infected tissue, and pathogenicity of the isolate was tested by paper pots tear bottom dipping root methods.The isolate was identified based on their pathogenicity, morphology, and sequence analysis of rDNA-ITS. The colony morphology, conidiophores, and conidia of the isolates were identical toVerticilliumdahliae. The rDNA-ITS sequence showed 99.0% homology with that of China cotton isolate ofV.dahliae(Accession EU835817.1). Thus, the pathogen causingVerticilliumwilt in elm was confirmed asV.dahliae.

elm;Verticilliumwilt;identification of pathogen

2015-02-06

2015-04-08

科技部中小企業(yè)創(chuàng)新項目(14C26216513812);石河子科技局地方基金項目(2012NY04)

E-mail:lgyshzu@163.com

S 763.13

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.048