一株熒蒽降解菌Rhodococcus erythropolis PJR1的篩選、鑒定及降解特性研究

靳競男，劉文娟，劉建麗，姚　俊

(北京科技大學土木與環境工程學院，北京 100083)

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一株熒蒽降解菌Rhodococcus erythropolis PJR1的篩選、鑒定及降解特性研究

靳競男，劉文娟，劉建麗，姚俊

(北京科技大學土木與環境工程學院，北京 100083)

采用富集培養方法從大港油田原油樣品中篩選到一株熒蒽降解菌，對其降解特性進行了研究。通過16S rDNA序列比對，鑒定該菌株為Rhodococcus屬紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，并命名為PJR1。菌株PJR1對熒蒽的降解速率與其生長活性呈正相關：在第5～20 d，菌株PJR1對熒蒽的降解速率隨其生長活性的增強而不斷加快；20 d后，則隨其生長活性的減弱而減慢；30 d完成降解，降解率達到76.18%。GC-MS分析表明熒蒽代謝產物為9-芴酮、鄰苯二甲酸和苯甲酸。為進一步探討熒蒽在Rhodococcus屬中的代謝路徑及機制奠定了基礎。

生物降解；熒蒽；紅球菌屬；降解特性

多環芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是含有2個以上芳香環的有機類環境污染物質，主要來源于石油、煤炭和固體廢棄物等含碳化合物在高溫下的不完全燃燒[1-2]。美國環境保護署已經將16類PAHs認定為優先控制的環境污染物[3]。由于PAHs對人類具有潛在的毒性、致癌性和致突變性，已引起研究者的廣泛關注?；瘜W結構的復雜性和高疏水性導致PAHs在環境中的殘留時間較長，并且難以去除[4]。熒蒽是一種具有4個稠合芳香環的高分子量PAHs，其化學結構與其它致癌性的高分子量PAHs具有一定的相似性。因此，它通常被作為模式化合物來研究高分子量PAHs的降解機制及毒理學性質[5]。

生物修復是利用微生物代謝多樣性的特點來達到去除污染物的目的[6]，是一種生態友好、低成本的污染治理技術。作者通過生物富集培養方法從大港油田原油樣品中篩選到1株高效降解熒蒽的菌株，并對其代謝產物進行定性研究，對熒蒽在該菌株作用下的代謝路徑進行探討，擬為熒蒽的微生物降解機制研究提供有效的科學依據。

1　實驗

1.1材料與培養基

原油樣品取自大港油田港西43-3-3#油井。

無機鹽液體培養基(1L)：0.50gKH2PO4，1.26gNa2HPO4·12H2O，3.00g(NH4)2SO4，0.54gMgSO4·7H2O，0.15mgMnSO4·H2O，0.50mgFeCl3·6H2O，0.24mgZnSO4·7H2O，3.66mgCoCl2·6H2O，0.30mgFeSO4·7H2O。在121 ℃高溫滅菌30min。

無機鹽固體培養基：在無機鹽液體培養基中添加1.6%的瓊脂。

1.2菌株的富集培養與分離

將5%的原油樣品添加到含有1g·L-1熒蒽的100mL無機鹽液體培養基中，于30 ℃、150r·min-1振蕩培養10d，富集培養3次。將溶于乙酸乙酯的熒蒽溶液涂布于無機鹽固體培養基上，然后接種上述培養液，30 ℃恒溫培養10d，至單菌落形成。挑取邊緣整齊生長迅速的單菌落于無機鹽液體培養基中復篩，重復3次，得到單一的目的菌株[7]。

1.3菌株的鑒定

取2mL培養至對數期的菌液，于10 000r·min-1離心1min，棄上清液，收集菌體。通過細菌基因組DNA提取試劑盒(美國Omega公司)提取總DNA。利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。反應總體系25μL：2×TaqMasterMix12.50μL，正向和反向引物各1.00μL，總DNA0.50μL，ddH2O10.00μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性1min；94 ℃變性1min，54 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，循環30次；72 ℃延伸10min。PCR產物經純化后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

菌株16SrDNA序列的測定由上海生工生物工程股份有限公司完成。采用BLAST程序與GenBank數據庫中的同屬已知序列的核苷酸序列進行比對，通過MEGA5.0中的Neighbor-Joining模型構建系統發育樹，對該菌株進行鑒定。

1.4菌株對熒蒽的降解特性研究

1.4.1熒蒽降解率的測定

在100 mL無機鹽液體培養基中加入100 mg·L-1熒蒽，隨后加入1 mL菌懸液(OD600=0.20)，30 ℃培養30 d。每5 d取樣測定培養液中熒蒽的殘留量，計算熒蒽降解率，考察菌株對熒蒽的降解特性。以加入熱滅活菌懸液的樣品作為對照。每個樣品設3個重復。

1.4.2熒蒽代謝產物的GC-MS分析

取5 mL培養液，加入15 mL乙酸乙酯提取3次，合并提取液。用無水Na2SO4填充柱去除提取液中殘留的水分，再通過旋轉蒸發儀將提取液濃縮至2 mL，用QP2010SE型GC-MS(日本島津公司)分析熒蒽代謝產物[7]。

GC-MS條件：HP-5色譜柱(30.00 m×0.32 mm，0.25 μm)，以氦氣作為載氣(40 cm3·s-1)；柱溫在60 ℃保持1 min，然后以10 ℃·min-1的速度升溫至320 ℃，保持10 min；質譜設置為電子轟擊模式，電離能為70 eV，離子源溫度為230 ℃。

2　結果與討論

2.1菌株的鑒定

以熒蒽作為唯一碳源和能源，通過富集培養，分離篩選到一株能夠有效降解熒蒽的菌株。通過16S rDNA基因序列的測定，最終得到1 426 bp的部分保守核苷酸序列。BLAST比對結果表明，該菌株的16S rDNA序列與Rhodococcus屬的細菌具有高度同源性，其中與Rhodococcuserythropolisstrain BZ4的同源性高達99%。采用Neighbor-Joining模型構建系統發育樹，Bootstrap值為1 000，并用Bootstrap對進化樹的可信度進行檢驗，進一步確定該菌株的分類學地位(圖1)，最終將該菌株鑒定為紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，命名為PJR1。該菌株的16S rDNA基因序列已保存在GenBank數據庫中，編號KP257578。根據《伯杰氏系統細菌學手冊》，紅串紅球菌是介于Nocardiaceae科和 Rhodococcus科之間的一類微生物，屬于革蘭氏陽性菌，菌落為乳白色，隆起，邊緣完整，表面光滑，不透明，好氧，化能異養。這一結果也得到了本實驗的驗證。

圖1熒蒽降解菌RhodococcuserythropolisPJR1的系統發育樹

Fig.1Phylogenetic tree of fluoranthene-degrading strainRhodococcuserythropolisPJR1

2.2菌株PJR1對熒蒽的降解特性

菌株PJR1的生長曲線及其對熒蒽的降解率如圖2所示。

圖2　菌株PJR1的生長曲線及其對熒蒽的降解率

由圖2可以看出，降解初始，細菌的生長活性與熒蒽的降解率呈正相關，呈現出快速上升的趨勢；在第5～20 d，降解速率較快，降解率為27.58%～68.08%；但隨著培養時間的延長，細菌生長活性下降，菌株PJR1對熒蒽的降解速率減緩；第30 d時，降解率達到76.18%。表明菌株PJR1對熒蒽具有良好的降解能力。

2.3熒蒽代謝產物分析

對培養液進行GC-MS分析，共檢測到3種熒蒽代謝產物：9-芴酮、鄰苯二甲酸和苯甲酸，具體的保留時間(tR)和碎片離子的m/z見表1。

表1熒蒽及其代謝產物的保留時間(tR)和碎片離子的m/z

Tab.1　Retention time(tR) and m/z of fragment ions of fluoranthene and its metabolites

Kelley等研究表明，熒蒽的降解起始于熒蒽芳香環上C1-C2原子的雙羥基化反應，形成中間體1,2-二羥基熒蒽；在微生物各種氧化還原酶的作用下，中間體9-芴酮-1-甲酸形成并發生脫羧反應，生成9-芴酮[8-9]；隨之9-芴酮作為代謝中間體經過與芴和萘相同的代謝路徑，其鄰位碳原子發生雙氧化反應，形成中間體鄰苯二甲酸[10-11]，鄰苯二甲酸進一步脫羧形成苯甲酸[12]。

菌株PJR1在降解熒蒽的過程中，通過一系列的氧化還原反應形成中間體9-芴酮，之后通過鄰苯二甲酸代謝路徑進一步降解，生成無毒或毒性更低的小分子物質，最終通過三羧酸循環生成二氧化碳和水，如圖3所示。

圖3　熒蒽在菌株PJR1中的代謝路徑

3　結論

從大港油田原油樣品中篩選到一株熒蒽高效降解菌。通過16S rDNA序列比對，鑒定該菌株屬于Rhodococcus屬紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，命名為PJR1。菌株PJR1對熒蒽的降解速率與細菌生長活性呈正相關，30 d的降解率達到76.18%。GC-MS檢測到3種熒蒽代謝產物，分別是9-芴酮、鄰苯二甲酸和苯甲酸，由此得出，鄰苯二甲酸代謝路徑參與了菌株PJR1對熒蒽的降解過程。為進一步研究熒蒽在Rhodococcus屬細菌中的降解機理奠定了理論基礎。

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Screening,Identification and Degradation Properties of a Fluoranthene-Degrading StrainRhodococcuserythropolisPJR1

JIN Jing-nan,LIU Wen-juan,LIU Jian-li,YAO Jun

(SchoolofCivilandEnvironmentalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China)

Afluoranthene-degradingstrainwasisolatedfromcrudeoilinDagangOilfieldbyenrichmentculture,anditsdegradationpropertieswerestudied.Basedonthesequencealignmentof16SrDNA,itwasidentifiedasRhodococcus erythropoliswhichbelongedtoRhodococcusandnamedasPJR1.ThedegradationspeedofstrainPJR1waspositivecorrelationwithitsgrowthactivity.Duringtheperiodof5～20dculture,thedegradationspeedofstrainPJR1increasedwiththeimprovementofgrowthactivity,20dlater,bothofthedegradationspeedandgrowthactivitydecreased.Finally,thedegradationcompletedin30dwithdegradationrateof76.18%.GC-MSAnalysisshowedthat,metabolitesoffluoranthenewere9-fluorenone,phthalicacidandbenzoicacid.ThisstudyprovidesatheoreticalbasisforthefurtherresearchofmetabolicrouteandmechanismoffluorantheneinRhodococcus.

biodegradation;fluoranthene;Rhodococcus;degradationproperty

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.008

國家自然科學基金杰出青年科學基金資助項目(41273092)

2016-03-09

靳競男(1986-)，女，河南焦作人，博士研究生，研究方向：有機污染物的生物修復，E-mail：jinjingnan2010@163.com；通訊作者：姚俊，教授，E-mail：yaojun@163.com。

Q 939.9

A

1672-5425(2016)08-0035-04

靳競男，劉文娟，劉建麗，等.一株熒蒽降解菌RhodococcuserythropolisPJR1的篩選、鑒定及降解特性研究[J].化學與生物工程，2016，33(8)：35-38.