基于UPLC/Q-TOF MS代謝組學技術(shù)分析影響遠志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素

許曉雙， 張艷花， 王丹丹，張福生， 秦雪梅， 彭　冰， 曾祖平

(1山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原　030006; 2山西大學化學化工學院； 3北京市中醫(yī)研究所, 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院； *通訊作者，E-mail：ample1007@sxmu.edu.cn)

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基于UPLC/Q-TOF MS代謝組學技術(shù)分析影響遠志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素

許曉雙1,2， 張艷花1,2， 王丹丹1,2，張福生1*， 秦雪梅1， 彭冰3， 曾祖平3

(1山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原030006;2山西大學化學化工學院；3北京市中醫(yī)研究所, 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院；*通訊作者，E-mail：ample1007@sxmu.edu.cn)

目的針對性地分析了產(chǎn)地、生長方式、藥用部位等因素對山西產(chǎn)遠志商品藥材質(zhì)量的影響，并找出關(guān)鍵影響因素。 方法首先將樣品進行超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜分析，并采用主成分分析及聚類分析等多元統(tǒng)計學方法，分別比較了產(chǎn)地、生長方式、藥用部位等因素對山西產(chǎn)遠志商品藥材質(zhì)量的影響。結(jié)果①產(chǎn)地因素是影響現(xiàn)有遠志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，指標性成分3,6’-二芥子酰基蔗糖與遠志口山酮Ⅲ的含量高低可以間接反映出遠志藥材整體質(zhì)量。②山西石樓、靜樂、盂縣的野生遠志質(zhì)量較優(yōu)，而襄汾、聞喜的栽培遠志質(zhì)量較好。③遠志筒中化合物的相對含量高于根，根與筒間的主要差異物質(zhì)為Sibiricoses A6，3,6’-二芥子酰基蔗糖，Tenuifoliose C，遠志口山酮Ⅲ，遠志根與筒的選擇依據(jù)應充分考慮臨床所治療疾病的特性，而不能一概而論。 結(jié)論產(chǎn)地因素是影響現(xiàn)有遠志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，本研究為今后指導遠志規(guī)范化種植以及產(chǎn)地粗加工和臨床精確用藥提供了科學依據(jù)。

遠志；代謝組學；UPLC/Q-TOF MS；商品藥材；質(zhì)量

遠志是我國常用的大宗藥材之一，主產(chǎn)于山西、陜西、河北等地[1]，為多年生草本植物遠志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵葉遠志(P.SibiricaL.)的干燥根[2]。目前，山西產(chǎn)栽培遠志(P.tenuifolia)為市售遠志商品藥材的主要來源。由于中藥材藥效的強弱與藥材質(zhì)量的優(yōu)劣密切相關(guān)，而藥材質(zhì)量的優(yōu)劣與藥材中所含主要化學成分含量的高低緊密相關(guān)。遠志具有安神益智、祛痰消腫等功效[3]，其主要化學成分為皂苷類、口山酮類、糖酯類等物質(zhì)，而產(chǎn)地(生長環(huán)境)、生長方式(野生、栽培)、生長年限、藥用部位(根-未抽心、筒-抽心)等因素又會對上述化學成分的含量產(chǎn)生或大或小的影響，但關(guān)鍵影響因素至今仍尚未闡明，這已嚴重制約了現(xiàn)有遠志商品藥材的生產(chǎn)與流通。

由于現(xiàn)有遠志藥材質(zhì)量優(yōu)劣評價體系仍存在著明顯不足[4,5]，而植物代謝組學技術(shù)(LC、GC、NMR等)可對植物提取物進行無差別代謝成分的高通量全分析，擅長尋找不用樣品間的差異代謝物。超高液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF MS)技術(shù)是將液相的高分離效能與質(zhì)譜的強大結(jié)構(gòu)鑒定功能結(jié)合起來，是一項使中草藥中復雜化學成分得到快速分析的重要技術(shù)，且該技術(shù)在遠志化學成分的分析中已得到了成功應用[6-9]。因此，基于UPLC/Q-TOF MS的代謝組學技術(shù)具有備樣時間短、分析時間短、適用范圍廣且既可定性又可半定量等優(yōu)點，彌補了現(xiàn)有藥材質(zhì)量優(yōu)劣化學評價體系中的諸多不足[10]。本課題組前期[11]已成功采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學技術(shù)對不同生長年限遠志藥材中的次級代謝物進行了比較，客觀、全面地揭示生長年限對遠志藥材質(zhì)量的影響，也為現(xiàn)有中藥材質(zhì)量優(yōu)劣評價方法提供一種新的思路。鑒于目前遠志商品藥材的生長年限較為統(tǒng)一且藥材主要來源于山西，因此，本研究采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學技術(shù)，針對性地分析產(chǎn)地、生長方式、用藥部位等因素對山西產(chǎn)遠志商品藥材質(zhì)量的影響，并找出關(guān)鍵影響因素，以期為今后指導遠志的規(guī)范化種植以及產(chǎn)地粗加工和臨床精確用藥提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

ACQUITY UPLC I-Class/ Xevo G2 Q TOF(美國Waters公司)，色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm，美國Waters公司)，BSA124S電子天平(德國sartorius公司)，KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，甲醇(色譜純，Tedia.美國)，乙腈(色譜純，Tedia.美國)，甲醇(分析純≥99.5%，北京化工廠)，純凈水(杭州娃哈哈公司集團有限公司)。遠志藥材收集于山西臨汾的襄汾、石樓，運城的聞喜、夏縣，忻州的定襄、河曲、靜樂，陽泉的盂縣8個產(chǎn)地(見表1)，經(jīng)山西大學秦雪梅教授鑒定為遠志科植物遠志(P.tenuifoliaWilld.)的干燥根。上述遠志樣品分別經(jīng)人工去心后，得到遠志筒，每個產(chǎn)地有根、筒2份樣品(見表1)。憑證標本保存在山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。

1.2樣品制備

將表1中的遠志樣品分別采用四分法，平行三次取樣，研磨，過藥典三號篩，取粉末約1 g，精密稱定。置于具塞試管中，加入50 ml甲醇，混勻，稱重，超聲提取30 min，補足減失重量，靜置，過濾。取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜備用，每份樣品溶液平行進樣2次。

表1山西省不同產(chǎn)地不同生長方式遠志根與筒樣品表

Table 1The roots and cortices ofP.tenuifoliain different growth pattern of samples from different regions of Shanxi

編號來源(生長方式) 根(G)筒(T)1山西省臨汾市襄汾縣南賈村(栽培)G1T12山西省臨汾市石樓縣小蒜村(野生)G2T23山西省運城市聞喜縣辛村(栽培)G3T34山西省運城市夏縣中條山藥材市場(栽培)G4T45山西省忻州市定襄縣上靈山村(野生)G5T56山西省忻州市河曲縣巡鎮(zhèn)(野生)G6T67山西省忻州市靜樂縣朝陽山(野生)G7T78山西省陽泉市盂縣鄭溝村(野生)G8T8

1.3色譜條件

流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸水(B)，洗脫梯度為：0-1 min，5%A；1-3 min，5%-12%A；3-6 min，12%-20%A；6-10 min，20%-30%A；10-10.5 min，30%-35%A；10.5-13.5 min，35%-45%A；13.5-15 min，45%-50%A；15-18 min，50%-95%A；18-19 min，95%A；19-20 min，95%-100%A。運行時間為20 min，流速為0.4 ml/min，柱溫為40 ℃，進樣量2 μl。

1.4質(zhì)譜條件

遠志樣品在負離子模式下的離子化效果優(yōu)于正離子模式，故本文采用電噴霧負離子模式檢測。霧化氣體為高純度氮氣(N2)，碰撞氣體為超高純氦氣(He)。檢測的質(zhì)量數(shù)范圍為50-2 000 D，錐孔電壓40 V，毛細管電壓2.5 kV，源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣體流速為800 L/h,錐孔氣流量50 L/h，碰撞能量(CE)50-80 V，碰撞氣體：氬氣(Ar)。LockMass：亮氨酸腦啡肽，m/z為554.261 5。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學技術(shù)，分析產(chǎn)地、生長方式、藥用部位等因素對山西產(chǎn)遠志商品藥材質(zhì)量的影響，其備樣方法、色譜條件與質(zhì)譜條件[11,12]見1.3與1.4。然后結(jié)合UPLC/Q-TOF MS的總離子流色譜圖及文獻[7-9]，依據(jù)化合物的質(zhì)荷比、保留時間及特征碎片離子，對化合物進行推斷指認。UPLC/Q-TOF MS原始數(shù)據(jù)矩陣圖是由Waters公司自帶的軟件TransOmicsTM生成，對其進行面積歸一化后，采用SIMCA-P 13.0(Umetrics，Umea，Sweden)軟件進行主成分分析(PCA)，再用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進行外部模型驗證，然后再用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)及S-plot分析找出差異代謝產(chǎn)物。采用SPSS 16(IBM SPSS, USA)軟件對原始數(shù)據(jù)矩陣進行聚類分析，并對不同組內(nèi)樣品差異代謝物相對含量進行獨立t檢驗(Independent-Samples T Test)，最后運用GraphPad Prism 5.0(USA)軟件對遠志中化合物的相對含量進行作圖。

2　結(jié)果

2.1UPLC/Q-TOF MS圖譜分析

基于UPLC/Q-TOF MS數(shù)據(jù)，本文共推斷指認出29個化合物(見表2)，其中包括：6個寡糖酯類(No.1-6)，4個口山酮類(No.7-10)，10個低聚糖類(No.11-20)及9個皂苷類(No.21-29)。

表2基于UPLC/Q-TOF-MS (負離子模式)推斷指認的化合物

Table 2Compounds identification ofP.tenuifoliabased on the UPLC/Q-TOF MS(negative ion mode)

編號化合物名稱 分子式保留時間(min)分子量測量值理論值主要離子碎片(m/z)參考文獻1SibiricosesA5C22H30O142.2975517.1554517.1563160.0155,175.0389,193.050672SibiricosesA6C23H30O152.5591547.1660547.1668175.0022,190.0258,205.0492,341.1063,367.102183TenuifolisideBC30H36O174.5026667.1874667.1880137.0233,190.0259,205.0491,239.0550,461.1230743,6’-Disinapoylsu-croseC34H42O195.59361507.44871507.4568367.1017,529.1556,547.1666,753.2246,205.045975TenuifolisideAC31H38O176.3578681.2033681.2036137.0223,179.0337,239.0546,263.0561,281.0659,443.118476TenuifolisideCC34H44O197.4113767.2400767.2404190.0257,205.0492,223.0589,237.0763,265.0708,367.0992,529.155987LancerinC19H18O103.2560405.0807405.0822257.0449,285.042378SibiricaxanthoneAC24H26O143.6405537.1243537.1250243.0288,267.0287,285.0385,297.0389,387.0622,405.082279PolygalaxanthoneⅢC25H28O154.1643567.1352567.1355315.0491,357.0477,272.0311,345.05917101,6-Dihydroxy-3,7-dimethoxyxanthoneC15H12O611.3884287.0547287.0553272.0294711TenuifolioseLC67H84O387.51831495.44841495.4568145.0283,795.2336,1039.3152,1081.3248,1143.3423,1161.3529,1203.3630,1307.3900712TenuifolioseKC57H70O327.59541265.37621265.3777851.2695,973.2956,997.3049,1077.3441,1119.3379813TenuifolioseFC68H86O397.71231525.45671525.4668795.2344,1039.3168,1143.3463,1203.3606,1379.4071814TenuifolioseCC58H72O337.84631295.38681295.3883851.2665,973.3097,997.3091,1119.3455715TenuifolioseⅠC59H72O338.13421307.38661307.3926145.0282,163.0387,997.3039,1101.3309,1119.3409,1143.3359,1161.3508,1247.3812,1265.3744716TenuifolioseGC66H84O386.67161483.44881483.4568175.0385,753.2220,997.3002,1119.3412,1161.3560717TenuifolioseBC60H74O348.38881337.39661337.39891101.3317,1119.3401,1161.3534,1295.3958718TenuifolioseHC61H74O349.05331349.39651349.3989145.0281,1203.3624719TenuifolioseNC63H78O369.52571409.41551409.4200337.0911,703.2092,825.2554,1051.3103,1069.3279,1191.3634720TenuifolioseAC62H76O359.33361379.40651379.40941203.3619,1161.3524,1039.3153,1143.3455,1119.3451721PolygalasaponinxxⅧC53H84O249.06591103.52801103.5280425.3049,455.3155722OnjisaponinTFC59H94O289.34871249.58401249.5894425.3048,455.3156723OnjisaponinTEC70H110O369.39481525.66041525.66991381.6287724OnjisaponinSC81H122O4011.60581733.72081733.7440425.3067 7-925SeneginⅣC80H120O3911.95691703.71351703.7329699.2354,1480.6761,1673.7063 7,826OnjisaponionTC84H128O4112.19191791.72351791.74891761.7156727SeneginⅢC75H112O3512.29791571.67981571.69061348.6349,1541.1254928PolygalasaponinXXXⅡC79H118O3812.51541673.70411673.72281449.6639729OnjisaponinWC81H120O4012.92191731.72311731.72831587.67327

3,6’-Disinapoyl sucrose：3,6’-二芥子酰基蔗糖；Polygalaxanthone Ⅲ：遠志口山酮Ⅲ

為了進一步明確這29個化合物在遠志樣品中的含量變化，將UPLC/Q-TOF MS數(shù)據(jù)的所有保留時間對應的色譜峰面積進行歸一化后，將上述化合物的相對含量的百分比做柱狀圖分析(見圖1)。結(jié)果表明，這29個化合物在遠志根與筒中的相對含量各不相同，其中以Tenuifoliside A的相對含量為最高。由圖1可知，Lancern，1,6-dihydroxy-3,7-dimethoxyxanthone,Tenuifoliose L,Tenuifoliose K,Tenuifoliose F,Tenuifoliose G,Tenuifoliose N,Tenuifoliose A,Onjisaponin TF,Onjisaponin TE,Onjisaponin S,Onjisaponin T,Onjisaponin W,Polygalasaponin ⅩⅩⅩⅡ14個化合物的相對含量較小(<0.25%)，因此推測這14個化合物的含量即使發(fā)生變化，對遠志根與筒的總化學成分含量影響也較小。因此，在本文后續(xù)的多元統(tǒng)計學分析以及差異代謝物的尋找過程中，這14個化合物將不予繼續(xù)指認與分析。

1.sibiricoses A5； 2.sibiricoses A6； 3.Tenuifoliside B； 4.3,6’-Disinapoly sucrose； 5.Tenuifoliside A； 6.Tenuifoliside C； 7.Lancerin； 8.Sibiricaxanthone； 9.Polygalaxanthone Ⅲ； 10.1,6-Dihydroxy-3，7-dimethoxyxanthone； 11.Tenuifoliose L； 12.Tenuifoliose K； 13.Tenuifoliose F； 14.Tenuifoliose C； 15.Tenuifoliose I； 16.Tenuifoliose G； 17.Tenuifoliose B； 18.Tenuif-oliose H； 19.Tenuifoliose N； 20.Tenuifoliose A； 21.Polygalasaponin ⅹⅹ Ⅷ； 22.Onjisaponin TF； 23.Onjisaponion TE； 24.Onjisaponin S； 25.Senegin Ⅳ； 26.Onjisaponion T； 27.Senegin Ⅲ； 28.Polygalasaponin ⅩⅩⅩⅡ； 29.Onjisaponin W圖1　遠志根與筒中29個化合物的相對含量Figure 1　The relative contents of 29 compounds in the roots and cortices of P.tenuifolia

2.2遠志商品藥材質(zhì)量的影響因素分析

產(chǎn)地、生長方式、用藥部位等是目前影響遠志商品藥材質(zhì)量的主要因素。首先，將表1中遠志樣品分別按上述因素進行分類：①產(chǎn)地因素：1，3，4號樣品產(chǎn)于山西南部(晉南)，6號樣品產(chǎn)于山西北部(晉北)，2，5，7，8號樣品產(chǎn)于山西中部(晉中)；②生長方式因素：1，3，4號樣品為栽培品，2，5，6，7，8號樣品為野生品；③藥用部位因素：1-8號樣品均分別包含根與筒。

為了進一步明確產(chǎn)地、生長方式、用藥部位等因素對遠志商品藥材質(zhì)量影響的大小，故將表1中8個不同產(chǎn)地遠志樣品的UPLC/Q-TOF MS原始數(shù)據(jù)經(jīng)面積歸一化后，分別進行PCA分析(見圖2A)和聚類分析(見圖2B)。

圖2A結(jié)果表明：①同一個產(chǎn)地的遠志根與筒無明顯區(qū)分；②1，3，4號樣品(晉南，栽培)無明顯區(qū)分，與7號樣品(晉中，野生)同在t[1]軸的左邊；③6號樣品(晉北，野生)與2，5，7，8號樣品(晉中，野生)同在t[1]軸的右邊，且與5、8號樣品無明顯區(qū)分。上述結(jié)果表明，PCA分析只能明確產(chǎn)地及生長方式因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響強于藥用部位。

圖2B(采用歐氏距離測量及Ward法連結(jié)作圖的聚類分析圖)結(jié)果表明：①同一個產(chǎn)地的遠志根與筒均明顯聚為一類；②閾值為20時，1，3，4號樣品與其他樣品分別聚為兩大類；③閾值為17時，1，3，4為一類，6單獨為一類，2，5，7，8則為另一類。該聚類分析結(jié)果與之前PCA分析結(jié)果基本一致。

綜上所述，PCA與聚類分析均只能明確產(chǎn)地及生長方式因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響強于藥用部位，而無法判斷產(chǎn)地與生長方式對遠志商品藥材質(zhì)量影響的大小。因此，本文將繼續(xù)針對產(chǎn)地、生長方式、藥用部位三因素分別進行單因素分析，以期從中找出影響遠志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

A.PCA散點圖　　　　　　　　　　　　　　　　　B.聚類分析圖2　遠志樣品的PCA散點圖和聚類圖(G1-G8，T1-T8見表1)Figure 2　The scattered plots of PCA (A) and clustering plot (B) of all the roots and cortices of P.tenuifolia (G1-G8，T1-T8 seen in Table 1)

2.2.1產(chǎn)地因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響首先，分別對栽培(1，3，4號樣品，圖3A-C)與野生(2，5，7，8號樣品，圖3D-H)遠志樣品進行PCA分析，并通過逐漸減少產(chǎn)地，進而驗證產(chǎn)地因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響大于藥用部位(見圖3)。結(jié)果表明：①隨著產(chǎn)地的減少，栽培遠志樣品的根與筒沿t[1]軸分開的趨勢越來越明顯(圖3A-C)；②野生遠志樣品按不同產(chǎn)地可明顯區(qū)分(見圖3D)，且去掉6號樣品后，剩余遠志樣品間區(qū)分的趨勢未變(見圖3E)；③無論繼續(xù)去掉7號樣品或2號樣品，對剩余遠志樣品的PCA分類趨勢均無明顯影響(見圖3F-G)；④當產(chǎn)地減少為兩個時，同一產(chǎn)地的遠志根與筒才可明顯區(qū)分(見圖3H)。該結(jié)果與之前PCA與聚類分析(見圖2)結(jié)果一致，驗證了產(chǎn)地因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響明顯大于藥用部位。

之后，為了進一步明確不同產(chǎn)地對遠志商品藥材質(zhì)量影響的大小，故將遠志中的15個主要化合物(圖1中相對含量>0.25%)進行相對含量堆積后，做柱狀圖分析(見圖4)。結(jié)果表明：①遠志筒中主要化合物的相對含量高于遠志根(見圖4A)，2，7，8號遠志樣品(野生)和1，3號遠志樣品(栽培)中主要化合物的相對含量分別高于同類其他樣品，提示上述遠志樣品質(zhì)量較優(yōu)；②1-8號遠志樣品中的3,6’-二芥子酰基蔗糖(圖4B)、遠志口山酮Ⅲ(圖4C)、寡糖酯類(圖4D)、口山酮類(圖4E)化合物的相對含量變化趨勢與圖4A基本一致，提示以3,6’-二芥子酰基蔗糖、遠志口山酮Ⅲ作為遠志含量測定的指標性成分，有一定的科學依據(jù)；③低聚糖類(圖4F)與皂苷類(圖4G)化合物的相對含量變化趨勢與圖4A不完全相同，推測皂苷類化合物相對含量較低的原因可能與遠志樣品制備方法有關(guān)。

2.2.2生長方式因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響生長方式是影響遠志商品藥材質(zhì)量的另一個重要的因素。由于在樣品收集時，未能收集到同一產(chǎn)地的野生與栽培遠志樣品，因此本文只評價栽培遠志與野生遠志的整體化學成分差異。圖4A的結(jié)果已表明，栽培遠志中主要化合物相對含量的變化范圍要小于野生遠志。

為了進一步了解生長方式因素對遠志商品藥材質(zhì)量影響的大小，故采用突出組間差異的有監(jiān)督的PLS-DA來分析栽培與野生遠志樣品間的化學差異。PLS-DA的分析是以外部模型成立為基礎(chǔ)，本文外部模型驗證的參數(shù)分別為(R2X=0.381，R2Y=0.980，Q2=0.978)，且左端任何一次隨機排列產(chǎn)生的R2、Q2均小于右端，表明該模型有效可靠。隨后，依據(jù)S-plot得分散點圖并結(jié)合VIP>1來尋找栽培與野生間差異代謝物，共找到12個差異代謝物(見表3)，分別為：寡糖酯類5個：Sibiricoses A5，Sibiricoses A6，Tenuifoliside B，Tenuifoliside A，Tenuifoliside C；口山酮類(1個)：Sibiricaxanthone A；低聚糖類3個：Tenuifoliose C，Tenuifoliose Ⅰ，Tenuifoliose B；皂苷類3個：Polygalasaponin XXⅧ,Senegin Ⅲ,Senegin Ⅳ。

與栽培遠志相比，野生遠志中的Sibiricoses A5(P<0.001)、Sibiricoses A6(P<0.001)、Sibiricaxanthone A (P<0.001)、Tenuifoliside B(P<0.001)、Tenuifoliside A(P<0.001)、Senegin Ⅳ(P<0.01)相

圖3　栽培(A,B,C)與野生(D,E,F,G,H) 遠志樣品依次減少的PCA散點圖(G1-G8，T1-T8見表1)Figure 3　The PCA scattered plots of decreasing numbers of cultivated(A,B,C) and wild(D,E,F,G,H) samples of P.tenuifolia (G1-G8，T1-T8 found in Table 1)

對含量較高，而Tenuifoliside C(P<0.001)、Tenuifoliose C(P<0.001)、Tenuifoliose I(P<0.05)、Tenuifoliose B(P<0.001)、Polygalasaponin xxⅧ(P<0.05)、Senegin Ⅲ(P<0.01)相對含量較低。該結(jié)果表明，野生遠志中的口山酮類與寡糖酯類物質(zhì)含量較高，而栽培遠志中的皂苷類與低聚糖類物質(zhì)的含量則較高。

2.2.3藥用部位不同對遠志商品藥材質(zhì)量的影響藥用部位(根與筒)的選擇是影響現(xiàn)有遠志商品藥材質(zhì)量的主要因素之一,而之前的結(jié)果已表明，遠志筒中主要化合物的相對含量高于遠志根(見圖4A)。為了進一步明確遠志筒與根中的主要化學差異，本文采用2.2項下相同的方法尋找差異代謝物。遠志根與筒的PLS-DA分析的模型驗證的參數(shù)分別為R2X=0.481，R2Y=0.948，Q2=0.916，且左端任何一次隨機排列產(chǎn)生的R2、Q2均小于右端，表明該模型有效可靠。依據(jù)S-plot的得分散點圖并結(jié)合VIP>1來尋找遠志根與筒間的差異代謝物，共找到12個差異代謝物(見表4)，分別為：寡糖酯類5個：Sibiricoses A5，Sibiricoses A6，3,6’-二芥子酰基蔗糖，Tenuifoliside B，Tenuifoliside A;口山酮類1個：Sibiricaxanthone A;低聚糖類4個：Tenuifoliose C;Tenuifoliose I，Tenuifoliose B，Tenuifoliose H;皂苷類2個：Polygalasaponin XXⅧ，Senegin Ⅲ。

圖4　不同產(chǎn)地遠志根與筒中總化合物(A)，3’6-二芥子酰基蔗糖(B)，遠志口山酮Ⅲ(C)，寡糖酯類化合物(D)，口山酮類化合物(E)，低聚糖類化合物(F)，皂苷類化合物(G)的相對含量變化折線圖(產(chǎn)地1-8見表1)Figure 4　The relative contents of all comprounds(A),3,6’-Disinapoyl sucrose(B), Polygalaxanthone Ⅲ(C),Oligosaccharide esters(D),Xanthones(E),Oligosaccharides(F),and Saponins(G) in roots and cortices of P.tenuifolia from different 8 regions(regions 1-8 see Table 1)

表3栽培與野生遠志指認的差異代謝物

Table 3Differential metabolites in different growth pattern of P. tenuifolia

編號名稱 保留時間(min)分子量VIP差異倍數(shù)(野生/栽培)1SibiricosesA52.2975517.15545.571.42↑***2SibiricosesA62.5591547.16604.661.45↑***8SibiricaxanthoneA3.6405537.12435.851.80↑***3TenuifolisideB4.5026667.18747.193.92↑***5TenuifolisideA6.3578681.20334.471.27↑***6TenuifolisideC7.4113767.24004.390.71↓***14TenuifolioseC7.84631295.38684.120.32↓***15TenuifolioseI8.13421307.38661.150.79↓*17TenuifolioseB8.38881337.39665.440.36↓***21PolygalasaponinⅹⅹⅧ9.06591103.52801.540.78↓*25SeneginⅣ11.95691703.71351.511.31↑**27SeneginⅢ12.29791571.67982.080.79↓**

與栽培的相比,↑,↓表示野生遠志中相對含量的升高或降低,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05；No.1-27見表1

表4結(jié)果表明，①除Tenuifoliose H、Senegin Ⅲ外，其余10個差異代謝物在遠志筒中的相對含量均高于遠志根，②只有Sibiricoses A6，3,6’-二芥子酰基蔗糖與Tenuifoliose C的相對含量在遠志根與筒中具有顯著差異。

3　討論

3.1實驗結(jié)果分析

本文采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學技術(shù)針對性地分析了產(chǎn)地、生長方式、藥用部位等因素對山西產(chǎn)遠志商品藥材質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地、生長方式因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響均大于藥用部位。此外，因客觀原因，本文未能收集到同一產(chǎn)地下的栽培與野生遠志樣品，因此在單因素分析過程中，暫無

表4遠志根與筒指認的差異代謝物

Table 4Differential metabolites in different samples of P. tenuifolia.

編號名稱 保留時間(min)分子量VIP差異倍數(shù)(筒/根)1SibiricosesA52.2975517.15541.031.02↑ 2SibiricosesA62.5591547.16607.531.17↑**8SibiricaxanthoneA3.6405537.12432.371.06↑3TenuifolisideB4.5026667.18743.721.16↑43,6’-二芥子酰基蔗糖5.59361507.44876.091.31↑***5TenuifolisideA6.3578681.20333.171.05↑14TenuifolioseC7.84631295.38683.681.34↑*15TenuifolioseI8.13421307.38663.121.20↑17TenuifolioseB8.38881337.39663.901.23↑18TenuifolioseH9.05331349.39651.650.93↓21PolygalasaponinⅹⅹⅧ9.06591103.52801.071.05↑27SeneginⅢ12.29791571.67982.930.91↓

與根相比,↑,↓表示筒中相對含量的升高或降低,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05； No.1-27見表1

法明確產(chǎn)地與生長方式中的哪個因素對遠志商品藥材質(zhì)量的影響更大。鑒于目前市售遠志商品藥材絕大部分為栽培遠志，且野生遠志藥材的蘊藏量少且產(chǎn)地不統(tǒng)一等諸多原因，因此本文最終推測產(chǎn)地因素是影響現(xiàn)有遠志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

3.2影響遠志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素分析

遠志商品藥材的質(zhì)量優(yōu)劣將直接影響到遠志的臨床療效，而產(chǎn)地因素又對遠志商品藥材質(zhì)量有較大影響，因此建議在選購山西產(chǎn)遠志商品藥材時，可以優(yōu)先考慮藥材的產(chǎn)地，如選擇晉南的栽培遠志或晉中的野生遠志，最后再考慮選擇遠志根或筒。由于遠志植物喜陽，目前，晉南地區(qū)是遠志商品藥材的主要種植基地，且質(zhì)量也相對穩(wěn)定；而晉中地區(qū)由于其地理位置的東西跨度較大，導致該地區(qū)的野生遠志分布較分散，進而引起野生遠志質(zhì)量差異較大，但該區(qū)域野生遠志中的口山酮類與寡糖酯類物質(zhì)含量相對較高，因此，建議可適當對晉中野生遠志品種進行遠志藥材的良種選育，且今后遠志的種植區(qū)域可適度從晉南向晉中小范圍遷移。此外，由于晉北地區(qū)不適宜遠志生長，且質(zhì)量較差，因此不建議在晉北地區(qū)種植遠志。

2015版《藥典》中，3,6’-二芥子酰基蔗糖、遠志口山酮Ⅲ、細葉遠志皂苷是評價遠志藥材質(zhì)量優(yōu)劣的指標性成分[2]。本文研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)(圖4)，3,6’-二芥子酰基蔗糖、遠志口山酮Ⅲ等單一成分的相對含量，分別與寡糖酯類、口山酮等單類化合物的相對含量以及遠志中主要化合物相對總含量的變化趨勢趨于一致，驗證了指標性成分3,6’-二芥子酰基蔗糖、遠志口山酮Ⅲ含量高低可以間接反映出遠志藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。此外，本課題組前期在研究不同生長年限對遠志藥材質(zhì)量的影響時，發(fā)現(xiàn)遠志口山酮Ⅲ等口山酮類和Tenuifoliose H等部分低聚糖類化合物的相對含量會隨著年限的延長而降低[11]；但就商品藥材來而言，1年生遠志根太細且產(chǎn)量太低，無法進入市場流通。因此，綜上所述，本文認為遠志口山酮Ⅲ可以作為評價遠志商品藥材質(zhì)量評價的指標性成分。另由于遠志樣品制備方法的不同，在本文的UPLC/Q-TOF MS圖譜分析中，未指認出細葉遠志皂苷。

3.3關(guān)于遠志商品藥材臨床用藥選擇依據(jù)的討論

本課題組曾對遠志筒與根進行了HPLC指紋圖譜及化學差異性分析，由于受材料樣品所限，未能對同一產(chǎn)地的遠志根與筒樣品進行分析，所得“遠志筒與根所含的有效成分含量存在一定的差異，但遠志根中有效成分的含量要高于遠志筒”結(jié)果有一定的片面性[13]。本文經(jīng)對同一產(chǎn)地遠志根與筒的差異性進行分析后證明：①遠志筒中主要化合物的相對含量高于遠志根，與文獻[14]所報道的結(jié)果一致，該結(jié)果也是對本課題組前期研究結(jié)果[13]的更正、補充與完善；②引起遠志根與筒間化學差異的主要差異代謝物為：Sibiricoses A6，3,6’-二芥子酰基蔗糖，Tenuifoliose C，而遠志口山酮Ⅲ雖未被指認成差異代謝物，但在筒中的相對含量高于根(見圖1)，與“根與筒間的主要差異物質(zhì)為3,6’-二芥子酰基蔗糖與遠志口山酮Ⅲ”結(jié)果[13]基本一致。

藥材發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是化學成分，Sibiricoses A6、3,6’-二芥子酰基蔗糖在遠志中均屬于寡糖酯類成分，而Tenuifoliose C則屬于低聚糖類成分。目前，已有研究證明上述成分是遠志安神及抗抑郁的活性成分。劉屏等[15]發(fā)現(xiàn)3,6’-二芥子酰基蔗糖對藥物誘發(fā)抑郁模型有顯著的抗抑郁活性；聶淑琴等[16]曾報道寡糖酯類化合物Tenuifoliside A在體內(nèi)腸道細菌的作用下，在腦內(nèi)能轉(zhuǎn)化成具有鎮(zhèn)靜活性的3，4，5-三甲氧基桂皮酸(TMCA)而產(chǎn)生持續(xù)的鎮(zhèn)靜作用。因此，建議今后在選用遠志藥材治療抑郁病、失眠等疾病時，可針對性地選擇上述成分含量較高的遠志筒；如要發(fā)揮遠志藥材的祛痰、消腫等功效時，遠志根與筒則可以混用。由此可見，遠志藥用部位(根與筒)的選擇，應充分考慮臨床所治療疾病的特性，而不能一概而論。該結(jié)果為遠志產(chǎn)地粗加工及臨床精確用藥提供了一定的科學依據(jù)。當然上述結(jié)果還有待于后續(xù)對遠志根與筒進行藥效學與毒理學(如《雷公炮炙論》：遠志，若不去心，服之令人悶)的進一步驗證。

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UPLC/Q-TOF MS-based metabolomics in analyzing the key factors affecting the quality of commercialPolygalatenuifolia

XU Xiaoshuang1,2, ZHANG Yanhua1,2, WANG Dandan1,2, ZHANG Fusheng1*, QIN Xuemei1, PENG Bing3, ZENG Zuping3

(1ModernResearchCenterforTraditionalChineseMedicine,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;2CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity;3BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity；*Correspondingauthor，E-mail：ample1007@sxmu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the effect of regions, growth patterns, and medical parts on the quality of commercialPolygalatenuifoliaand analyze the key influential factors.MethodsThe samples of commercialP.tenuifoliawere analyzed by the ultra-performance liquid chromatography(UPLC)-quadrupole time-of-flight mass spectrometry(Q-TOF MS), and the obtained data were analyzed using principal component analysis, cluster analysis, and other statistical analysis methods.ResultsThe results showed that the key factor affecting the quality of commercialP.tenuifoliawas the region, and the contents of 3,6’-disinapoyl sucrose and polygalaxanthone Ⅲ reflected indirectly the whole quality ofP.tenuifolia. The quality of wildP.tenuifoliain Shilou, Jingle, and Yu county and cultivatedP.tenuifoliain Xiangfen, Wenxi in Shanxi province was better than that from other regions. The relative content of main compounds in roots was higher than in cortices ofP.tenuifolia, and the main chemical difference between the roots and cortices were Sibiricoses A6, 3,6’-disinapoyl sucrose, tenuifoliose C and polygalaxanthone Ⅲ. Moreover, the choice between the roots and the cortices was in accordance with the characteristics of the clinical diseases.ConclusionThe key factor affecting the quality of commercialP.tenuifoliais the region and this study provides some scientific evidences for the directions of standardized cultivation, habitat processing, and accurate clinical medication ofP.tenuifoliain the future.

Polygalatenuifolia;metabolomics;UPLC/Q-TOF MS;commercial medicinal herbs;quality

國家科技支撐計劃資助項目(2011BAI07B05)；山西省科學技術(shù)發(fā)展計劃資助項目(20140313010-1)；山西省創(chuàng)新團隊基金資助項目(2013131015)

許曉雙，女，1988-10生，在讀碩士，E-mail：xxs1005@126.com

2015-12-29

R284

A

1007-6611(2016)03-0255-09

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.014