酶解-檸檬酸提取塔羅科血橙皮中的果膠及理化性質(zhì)研究

阮尚全，程曉琴，夏　旭，陳　婷，汪建紅（.內(nèi)江師范學(xué)院，化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江6499；2.四川省高等學(xué)校果類廢棄物資源化重點(diǎn)實驗室，四川內(nèi)江6499；3.四川恒通動物制藥有限公司，四川內(nèi)江64000）

酶解-檸檬酸提取塔羅科血橙皮中的果膠及理化性質(zhì)研究

阮尚全1，2，程曉琴1，3，夏旭1，陳婷1，汪建紅1，2
（1.內(nèi)江師范學(xué)院，化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641199；
2.四川省高等學(xué)校果類廢棄物資源化重點(diǎn)實驗室，四川內(nèi)江641199；
3.四川恒通動物制藥有限公司，四川內(nèi)江641000）

利用Design-Expert 8.05軟件，建立了以纖維素酶酶解-檸檬酸提取塔羅科血橙皮中果膠的實驗?zāi)Ｐ汀Ｗ罴烟崛」に嚄l件為：提取溫度90℃、時間30 min、pH2，驗證實驗得到果膠產(chǎn)率為29.447%，與果膠模型預(yù)測值29.928%的相對誤差為1.6%。果膠產(chǎn)品酯化度為67.84%、含水率為7.66%、半乳糖醛酸含量為75.8%、總灰分為3.83%、酸不溶性灰分為0.1%、pH為3.10。本文為提高血橙的綜合價值提供了理論依據(jù)和實驗方法。

血橙皮，果膠，檸檬酸，理化性質(zhì)

膳食纖維素分為水溶性和水不溶性膳食纖維，被稱為人體的第七大營養(yǎng)素，對人類健康具有重要作用［1］。果膠為與纖維素和半纖維素交聯(lián)在一起，是主要存在于植物細(xì)胞中的水溶性膳食纖維，按酯化程度不同分為高酯果膠和低脂果膠，在各領(lǐng)域中應(yīng)用十分廣泛［2-7］。目前，利用柑橘副產(chǎn)物制備膳食纖維主要為水溶性果膠，獲得的方法分為酸提取、堿提取、微生物發(fā)酵、酶法或輔以其他技術(shù)如微波技術(shù)、超聲波技術(shù)、離子交換樹脂等，分離主要為醇沉法、鹽析法、膜分離法等，提取一般都在較低的pH下進(jìn)行，傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)中常以無機(jī)酸調(diào)節(jié)酸度［8-9］。纖維素酶因能降解纖維素，改變細(xì)胞壁的通透性，縮短內(nèi)容物溶出的時間，在提高內(nèi)容物的產(chǎn)率和質(zhì)量方面，表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用潛力［10］。檸檬酸則為食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)大量使用的天然果酸，其羥三羧酸類結(jié)構(gòu)是一種優(yōu)良的絡(luò)合劑，可以絡(luò)合金屬離子，解除金屬離子對果膠的封閉，對提高果膠產(chǎn)率和品質(zhì)具有良好的影響，且目前廢液中的檸檬酸能有效的回收處理［11-13］。我國柑橘皮渣年產(chǎn)量在1000萬t以上，皮渣中果膠含量為20%～30%，是目前國內(nèi)提取商品化果膠的主要原料之一［14-15］。塔羅科血橙是唯一含花青素的橙類水果，僅四川省資中縣栽植已超過0.69萬hm2，年均產(chǎn)量超過20萬噸，果汁加工超過10萬噸，生產(chǎn)中產(chǎn)生的萬噸級皮渣得不到有效利用，其生物利用研究還處于初級階段，僅有少量研究報道［16-20］。本文綜合纖維素酶及檸檬酸的特性，建立酶解-檸檬酸提取塔羅科血橙皮中的果膠的數(shù)學(xué)模型，符合綠色化學(xué)理念，對產(chǎn)品的理化性質(zhì)進(jìn)行初步測定，為更好地綜合利用塔羅科血橙副產(chǎn)物提供新的實驗依據(jù)和方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

塔羅科血橙四川資中生產(chǎn)基地；纖維素酶（1.1萬U/g）四川山野生物科技有限公司；檸檬酸（AR） 成都金山化學(xué)試劑有限公司；乙醇（AR） 成都金山化學(xué)試劑有限公司。

DFT-100粉碎機(jī)浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司；AE240電子天平梅特勒-托利多中國有限公司；實驗室pH計奧豪斯儀器（上海）有限公司；恒溫水浴振蕩器上海璽袁科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A低速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；DZF-6090真空干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1提取工藝實驗用塔羅科血橙洗凈取皮，沸水滅酶5 min，水洗3～4次去色素和糖分，50℃烘干粉碎備用。準(zhǔn)確稱取血橙皮粉2.000 g于提取瓶中，加入蒸餾水及纖維素酶，于一定酶活溫度及pH下酶解，再以檸檬酸調(diào)節(jié)酸度，一定溫度下水浴振蕩提取，在4000 r/min下離心分離10 min，并洗滌殘渣2次，濾液合并后濃縮，加入濃縮液1.5倍的無水乙醇醇析果膠、過濾，以50%乙醇洗滌2～3次，產(chǎn)物于50℃烘干稱重，計算果膠產(chǎn)率。

1.2.2單因素實驗在料液自然pH下酶解，以料液比為1∶40、酶用量為0.7 mg/mL、酶解時間為45 min、酶解溫度為40℃、提取溫度為90℃、提取時間為20 min、提取pH為2作基礎(chǔ)條件。考查料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，酶用量為0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL，酶解時間為15、30、45、60、75 min，酶解溫度為30、35、40、45、50℃，提取時間為15、20、25、30、35 min，提取溫度為80、85、90、95、100℃，提取pH為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5時對果膠產(chǎn)率的影響。

1.2.3響應(yīng)面實驗設(shè)計實驗測得料液體系自然pH約為4.6。鑒于纖維素酶最佳活性pH為4～6、溫度為40～60℃，果膠的提取需要較高的溫度和酸度，當(dāng)提取pH大于3.0時，果膠易發(fā)生酯的皂化反應(yīng)和β-消除反應(yīng)，對產(chǎn)率影響大。所以，采用原料在溫和條件下預(yù)酶解后，重點(diǎn)考查檸檬酸提取實驗條件對果膠產(chǎn)率的影響，響應(yīng)面實驗因素水平及編碼見表1。

表1　響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平及編碼Table 1　Factors，levels and codes of RSM design

1.2.4產(chǎn)品理化性質(zhì)的測定果膠含水率參考GB5009.3-2010直接干燥法測定；總半乳糖醛酸含量參考GB25533-2010方法測定，并計算酯化度；總灰分、pH參考QB2484-2000測定；酸不溶灰分參照GB5009.4-2010測定。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實驗

2.1.1料液比對果膠產(chǎn)率的影響按照“1.2.2單因素實驗”，改變料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖1。

圖1　料液比對果膠產(chǎn)率的影響Fig.1　Effect of material-liquid ratio on the pectin extraction yield

由圖1可知，最初果膠產(chǎn)率隨著提取溶劑用量增大而增加，料液比1∶40時提取效果最佳，之后隨著提取溶劑用量增大而減小。因果膠析出與降解為動態(tài)過程，溶劑量少，果膠分子在粘度大的體系體系中擴(kuò)散速度慢，且不易攪拌，增加分離難度且果膠易損失。但溶劑量過大時，會增加低分量和高酯化度果膠的溶解度而在過濾洗滌中損失，至果膠產(chǎn)率降低。

2.1.2酶用量對果膠產(chǎn)率的影響按照“1.2.2單因素實驗”，改變酶用量為0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖2。

圖2　酶用量對血橙皮果膠產(chǎn)率的影響Fig.2　Effect of the amount of cellulase on the extraction yield of pectin

由圖2可知，加酶對果膠產(chǎn)率影響明顯，當(dāng)酶量為0.7 mg/mL時果膠產(chǎn)率最大，酶量小于0.7 mg/mL時，果膠產(chǎn)率隨著酶用量增大而增大。當(dāng)酶用量大于0.7 mg/mL時，果膠的產(chǎn)率隨著酶用量的增大而減小。纖維素酶系中包括內(nèi)切葡聚糖酶（C1酶）、外切葡聚糖酶（Cx酶）以及β-葡聚糖酶等，之所以加酶過大使果膠產(chǎn)率降低，原因可能是實驗用酶不純（工業(yè)級），其中外切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶等共同作用使果膠分子降解生成小分子量物質(zhì)而損失。

2.1.3酶解時間對果膠產(chǎn)率的影響按照“1.2.2單因素實驗”，改變酶解時間為15、30、45、60、75 min進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖3。

圖3　酶解時間對血橙皮果膠產(chǎn)率的影響Fig.3　Effect of time on the pectin extraction yield

由圖3可知：45 min為最佳酶解時間，在45 min之前，隨著時間增加果膠溶出增加，在45 min之后果膠產(chǎn)率呈逐漸降低的趨勢，這可能是當(dāng)果膠溶出到一定程度時，酶系中外切葡聚糖酶與β-葡聚糖酶等對果膠的降解致果膠產(chǎn)率下降。

2.1.4酶解溫度對果膠產(chǎn)率的影響按照“1.2.2單因素實驗”，改變酶解溫度為30、35、40、45、50℃進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖4。

圖4　酶解溫度對血橙皮果膠產(chǎn)率的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on the pectin extraction yield

由圖4可知：當(dāng)溫度在30～40℃之間，果膠產(chǎn)率隨溫度升高而增加，40℃時果膠產(chǎn)率最大，繼續(xù)提高溫度，果膠產(chǎn)率降低。這是由于升溫使分子熱運(yùn)動加快，同時酶活力也增強(qiáng)，纖維素降解加劇，使果膠溶出速度加快，產(chǎn)率出現(xiàn)上升趨勢。但溫度過高易至酶活降低或失活，同時果膠降解也加快，從而使果膠的產(chǎn)率降低。

2.1.5提取時間對果膠產(chǎn)率的影響按照“1.2.2單因素實驗”，改變提取時間為15、20、25、30、35 min進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖5。

圖5　提取時間對果膠產(chǎn)率的影響Fig.5　Effect of extracting time on the pectin extraction yield

由圖5可知：果膠產(chǎn)率隨著時間增加而增加，30 min時產(chǎn)率最高，繼續(xù)延長時間，果膠產(chǎn)率降低。因為提取時間太短，原料中原果膠未能完全脫離和水解，但此階段果膠的溶出起主導(dǎo)作用，故產(chǎn)率增加；隨著果膠溶出量逐漸減少，一定時間后，在較高溫度和酸性條件下果膠質(zhì)水解會起主導(dǎo)作用，致使果膠產(chǎn)率降低。

2.1.6提取溫度對果膠產(chǎn)率的影響按照“1.2.2單因素實驗”，改變提取溫度為80、85、90、95、100℃進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖6。

圖6　提取溫度對果膠產(chǎn)率的影響Fig.6　Effect of extracting temperature on the pectin extraction yield

由圖6可知：隨著提取溫度的升高，果膠產(chǎn)率增加，但溫度高于95℃時，產(chǎn)率降低。原因是提取溫度升高，分子熱運(yùn)動加快，利于果膠溶出，但溫度過高會致果膠水解加快，同時溶劑蒸發(fā)也加劇，致果膠產(chǎn)率降低。

2.1.7提取pH對果膠產(chǎn)率的影響按照“1.2.2單因素實驗”，改變提取pH為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖7。

由圖7可知：pH在1.0～2.0之間果膠產(chǎn)率變化不大，pH為1.5時果膠產(chǎn)率最大。酸度過低，果膠易發(fā)生脫脂反應(yīng)，且當(dāng)pH＜2.0時，檸檬酸用量（pKa1=3.13）會急劇增加，繼而提高成本和增加洗滌及分離難度。當(dāng)pH＞2.0時，果膠產(chǎn)率迅速降低，原因是提取液酸性變?nèi)酰z酸解作用變遲鈍，且果膠易發(fā)生酯的皂化和β-消除反應(yīng)，致果膠產(chǎn)率下降。

2.2響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果及分析

圖7　pH對果膠產(chǎn)率的影響Fig.7　Effect of pH on the pectin extraction yield

2.2.1響應(yīng)曲面實驗設(shè)計結(jié)果結(jié)合單因素實驗結(jié)果，在確定酶解pH為自然條件、酶用量為0.7 mg/mL、酶解時間為45 min、酶解溫度為40℃以及料液比為1∶40（g/mL）時，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計，以提取pH（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）三個因素為自變量考查檸檬酸提取條件的影響，以果膠產(chǎn)率（R1）為響應(yīng)值進(jìn)行實驗優(yōu)化，進(jìn)行12個試因?qū)嶒灐?個中心點(diǎn)實驗，結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計實驗實驗結(jié)果Table 2　RSM design and corresponding experimental results

2.2.2模型的方差分析經(jīng)Design-Expert 8.05軟件計算，得回歸模型為：R1=29.69-3.33A+1.52B-0.046C-0.11AB+0.16AC+0.23BC-3.09A2-2.77B2-1.63C2。模型方差分析見表3。

由表3可知：果膠提取模型極顯著，失擬項不顯著；R2=0.9748，說明模型及方程回歸效果好；R2Adj=0.9424，即模型可解釋94.24%響應(yīng)值的變化；CV%=3.29%，表明實驗隨機(jī)誤差小。以上數(shù)據(jù)表明實驗?zāi)Ｐ湍芎芎玫亟忉尡痉ㄌ崛」z的實驗方法，并對其產(chǎn)率進(jìn)行分析和預(yù)測。A及B對果膠產(chǎn)率影響極顯著，提取時間C影響不顯著，交互作用AB、AC、BC均不具顯著性，二次項A2、B2、C2影響均極顯著，F(xiàn)值反應(yīng)出各因子的主效關(guān)系是A＞B＞C。

表3　實驗?zāi)Ｐ偷姆讲罘治鯰able 3　Variance analysis of experimental model

2.2.3響應(yīng)面分析果膠的二次回歸方程的響應(yīng)面見圖8～圖10。

圖8～圖10表明：溶液pH、溫度和提取時間中的各因素均存在交互效應(yīng)，pH影響使曲線最為陡峭，其次為溫度、提取時間，結(jié)論與模型方差分析表一致。圖8知：在pH不變條件下，果膠產(chǎn)率隨溫度出現(xiàn)先增長后降低的趨勢，曲線表現(xiàn)為平緩；在提取溫度一定時，產(chǎn)率先隨pH增加略有增大，然后產(chǎn)率迅速下降，曲線表現(xiàn)為陡峭。圖9可知：隨著提取時間延長，果膠產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后減小趨勢較小，曲線較為平緩；在提取時間一定時，產(chǎn)率先隨pH增加略有增大，然后產(chǎn)率迅速下降，曲線表現(xiàn)為陡峭。由圖10可知：提取溫度不變時，果膠產(chǎn)率隨提取時間的增大而增加，表現(xiàn)為曲線平緩；提取時間不變時，溫度前期影響較大，后期較為平緩。

圖8　pH（A）和溫度（B）對果膠產(chǎn)率影響的響應(yīng)面Fig.8　Response surface of the pH（A）and temperature（B）on the pectin extraction yield

圖9　pH（A）和提取時間（C）對果膠產(chǎn)率影響的響應(yīng)面Fig.9　Response surface of the pH（A）and extraction time（C）on the pectin extraction yield

圖10　溫度（B）和時間（C）對果膠產(chǎn)率影響的響應(yīng)面Fig.10　Response surface of the temperature（B）and extraction time（C）on the pectin extraction yield

2.2.4驗證實驗結(jié)果本研究以經(jīng)濟(jì)價值高的果膠產(chǎn)率最大化為基礎(chǔ)，通過Design-Expert 8.05軟件優(yōu)化，得到果膠產(chǎn)率最大化的最佳工藝條件為：提取溫度92.87℃、提取時間30.19 min、pH為2.09，果膠產(chǎn)率預(yù)測值為30.545%。考慮操作的可行性與簡便，以提取溫度90℃、提取時間30 min、pH為2進(jìn)行驗證，此條件下果膠產(chǎn)率的預(yù)測值為29.928%。5次平行實驗的果膠產(chǎn)率均值為29.447%，與預(yù)測值的相對誤差分別為1.6%。說明實驗?zāi)Ｐ偷木哂袑嶋H應(yīng)用意義。

2.2.5果膠理化性質(zhì)測定結(jié)果果膠粗品色澤為米黃色，酯化度為67.84%，為高酯果膠；果膠含水率為7.66%，半乳糖醛酸含量為75.8%，酸不溶性灰分為0.1%。除pH3.10略高于QB2484-2000標(biāo)準(zhǔn)，其余指標(biāo)均符合GB標(biāo)準(zhǔn)。總灰分為3.83%，低于QB2484-2000中規(guī)定的灰分值。

3　結(jié)論

實驗利用了纖維素酶和檸檬酸的優(yōu)點(diǎn)輔助提取塔羅科血橙皮原料中的果膠。在酶用量為0.7 mg/mL、酶解溫度為40℃、料液比為1∶40、自然pH下酶解45 min后，以響應(yīng)面法優(yōu)化建立了檸檬酸提取果膠工藝的數(shù)學(xué)模型，最佳提取工藝條件為：提取溫度92.87℃、時間30.19 min、pH為2.09。在提取溫度為90℃、時間為30 min、pH為2時進(jìn)行實驗驗證，果膠產(chǎn)率為29.447%，與該條件下果膠預(yù)測值29.928%的相對誤差為1.6%。實驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測結(jié)果較好，產(chǎn)品理化性質(zhì)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果為工業(yè)化提取血橙皮渣中果膠提供了新的實驗依據(jù)及方法。

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Study on extraction of the pectin in the tarocco blood orange peel by hydrolysis-citric acid method and its physicochemical property

RUAN Shang-quan1，2，CHENG Xiao-qin1，3，XIA-Xu1，CHEN-Ting1，WANG Jian-hong1，2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641199，China；
2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling of the Sichuan Provincial College，Neijiang 641199，China；3.Sichuan Hengtong Animal Pharmaceutical Co.，Ltd.，Neijiang 641000，China）

Pectin in tarocco blood orange peel was extracted by hydrolysis-citric and the model was constructed with Design-Expert 8.05 software.The optimal extracting technological conditions were the extracting temperature 90℃，the time 30 min，the pH 2.In the verification test，the yield of the pectin was 29.447%，which relative errors was 1.6%for the model values of the pectin of 29.928%.The esterification degree，the moisture content，the galacturonic acid content，the total ash content，the acid insoluble ash content，and the pH of the pectin，respectively were 67.84%，7.66%，75.8%，3.83%，0.1%and 3.10.The theoretical basis and experimental method were provided by the experiment to advance the comprehensive value of blood orange.

blood orange peel；pectin；citric acid；physicochemical property

TS201.1

B

1002-0306（2016）04-0313-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.054

2015-08-19

阮尚全（1963-），男，本科，高級實驗師，主要從事光譜分析及天然產(chǎn)物分離與應(yīng)用方面的研究，E-mail：rsq2009nj@sina，com。

四川省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（13ZA0004）；內(nèi)江師范學(xué)院自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（12NJZ02）。