人心房成纖維細胞的體外培養與鑒定*

周偉，李妙齡，范學慧，李濤，王笑宇，于風旭

（西南醫科大學：1附屬醫院胸心外科；2心肌電生理學研究室，四川瀘州646000）

人心房成纖維細胞的體外培養與鑒定*

周偉1，李妙齡2，范學慧2，李濤2，王笑宇2，于風旭1

（西南醫科大學：1附屬醫院胸心外科；2心肌電生理學研究室，四川瀘州646000）

目的：探索和建立適用于人心房成纖維細胞體外培養及鑒定的可靠的技術方法。方法：采用組織塊貼壁法對人心房成纖維細胞進行體外細胞培養及傳代。并在倒置相差顯微鏡下觀察成纖維細胞的生長情況，利用波形蛋白免疫熒光染色進行細胞鑒定。結果：在倒置相差顯微鏡下人心房成纖維細胞呈長梭形、多角形，胞質透明，胞核2~3個，無自發性搏動，細胞免疫熒光檢測波形蛋白表達陽性。結論：建立了穩定培養人心房成纖維細胞的方法，為研究心肌纖維化相關疾病的發病機理提供了充足的種子細胞。

成纖維細胞；細胞培養；細胞鑒定

心房顫動是臨床實踐中最為常見的心律失常之一。目前研究表明，心房顫動的病理生理機制主要包括結構重構和電重構，而心房纖維化導致的結構重構是永久性房顫發生及持續的底物，在臨床中也發現心房纖維化是房顫發生結構重構的重要特點[1]。由于對心房纖維化的在體研究受諸多條件的限制，因此，建立一種便捷、安全的人心房成纖維細胞體外培養方法，對研究心房纖維化的特點及與房顫發生關系有重要意義。目前，國內外實驗室在進行人心房成纖維細胞體外培養時方法不一，主要包括組織塊貼壁法和酶消化法[2]。酶消化法主要是使用胰蛋白酶與膠原蛋白酶聯合消化組織塊后采用差速貼壁法分離得到心房成纖維細胞，此法雖獲取細胞時間短，但是步驟多，過程復雜，操作中易污染，且該法比組織塊貼壁培養法技術要求高，費用昂貴，同時還存在對細胞的機械損傷和化學污染[3]。因此，本研究以心臟手術患者右心耳組織為材料，通過優化組織塊貼壁法培養人心房成纖維細胞，且已獲得成功。現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 心房肌標本來源

經倫理委員會批準，患者知情同意后，實驗所獲人心房肌取自于西南醫科大學附屬醫院心胸外科體外循環手術患者。

1.1.2 主要試劑

DME/F-12 1∶1（1x）高糖培養基（hyclone公司），胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司），膠原酶Ⅱ（worthington公司），山羊抗兔波形蛋白（vimentin），兔抗山羊IgG及DaPi（Sigma公司），平衡鹽溶液（PBS），青鏈霉素（100X）。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代細胞分離培養

從西南醫科大學附屬醫院胸心外科體外循環心臟手術患者獲取右心耳組織約40 mg，置于盛有無菌PBS的EP管中，將EP管移入裝有冰的保溫杯中迅速送往實驗室進行細胞分離培養。在超凈操作臺上，將右心耳組織塊移入裝有PBS的3 cm培養皿中。用無菌眼科剪和鑷子去除外膜和脂肪，將組織塊剪成約1 mm3大小均勻小塊。PBS反復沖洗組織塊，至無血色為止，去除多余的PBS。將剪成小塊的組織塊移入裝有1 mL DMEM培養基的EP管中，用眼科剪盡量剪碎組織塊，然后將組織碎塊吸入到無菌玻璃瓶。用DMEM配制0.1%膠原酶Ⅱ溶液10 mL，過濾后備用。取5 mL酶液于有組織塊的玻璃瓶中，37℃水浴箱中消化10 min，然后去除上清液。再加入剩下的5 mL酶溶液，繼續37℃水浴箱中消化10 min后離心（1 000 r/m，5 min），去除上清液。加入10 mL含20%胎牛血清的DMEM高糖培養基，吹打混勻后用吸管將組織碎塊懸浮液吸入到10 cm的培養皿，放置于37℃、5%CO2培養箱中培養生長。前4 d避免大幅度移動培養皿，以免影響組織塊貼壁。如若培養基變渾濁，說明可能存在細菌污染，要將培養皿及時拿出培養箱，防止繼續污染其他細胞。4 d后可以在倒置顯微鏡下觀察到組織塊周邊爬出少許成纖維細胞，此后，需每天觀察培養基顏色變化，如若變黃，要及時更換培養基。

1.2.2 傳代培養

在原代培養2周左右，在倒置顯微鏡下可觀察到成纖維細胞幾乎已長滿培養皿的90%以上，此時可進行傳代培養。去除原培養基，加入5 mL PBS清洗兩次后，加2 mL 0.1%胰蛋白酶于37℃培養箱消化約2 min后，在倒置顯微鏡下觀察，待細胞收縮變圓后，立即加入3 mL含20%胎牛血清的DMEM培養基終止消化。輕輕吹打細胞，制成細胞懸液，然后離心（1 000 r/m，5 min），去除上清液，加含20%胎牛血清的DMEM，按1:2的比例分別接種到一新的10 cm培養皿，再將其放置于37℃、5%CO2培養箱中。

1.3 成纖維細胞的鑒定

1.3.1 形態學觀察

可直接在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態。

1.3.2 細胞免疫熒光染色鑒定

在傳代培養時，取稀釋后的細胞懸液接種到3 cm培養皿的載玻片上，加入含20%胎牛血清的DMEM培養1～2 d取出玻片，用0.01 mol/L PBS液清洗3次，每次3～5 min。去除PBS液，再加入1 mL 40 g/L多聚甲醛（4%）固定5～10 min，PBS液清洗3次，每次5～10 min。去除液體后加入1 mL 0.5%Triton×100室溫封閉30 min，PBS液清洗3次，每次5～10 min，洗滌時可用搖床輕微搖動。去除液體后加入1 mL 1%BSA室溫封閉1 h，盡量去除多余液體，取1 mL 1∶300的稀釋一抗（兔波形蛋白vimentin）加入到接種有成纖維細胞的載玻片上，對照組滴加PBS，4℃過夜。第二天用PBS液清洗3次，每次5～10 min，去除液體后加1 mL 1∶100稀釋二抗（抗兔）室溫避光孵育1 h，PBS液清洗3次，每次5～10 min。加入500 uL DAPI染細胞核，室溫避光孵育5 min，PBS液清洗3次，每次5～10 min。滴一滴抗熒光淬滅封片于載玻片上，蓋上貼有細胞的玻片，使細胞接觸封片液封片，便可于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 細胞形態學特征

心房成纖維細胞原代培養時可見黑色組織塊，4～5 d細胞開始從組織塊邊緣爬出，呈放射狀，排列較紊亂，有重疊現象，此后細胞數明顯增多，14 d左右可長滿培養皿（圖1），可見細胞體積較大，呈梭形，細胞質透明，胞體較大，胞核明顯，呈扁圓形，常含2～3個核，傳代細胞排列緊密，細胞呈長梭形、多角形，無搏動（圖2）。

圖1 不同倍數下的原代成纖維細胞（A：4×B：10×C：20×D：40×）

圖2 不同倍數下傳代成纖維細胞（A：4×B：10×C：20×D：40×）

2.2 細胞免疫熒光染色

將傳代培養貼壁于蓋玻片上的人心房成纖維細胞行波形蛋白熒光染色和DAPI細胞核染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到成纖維細胞波形蛋白抗原表達陽性，在藍色細胞核邊緣可見紅色的細胞漿呈絲狀改變，純度大于95%（圖3A），對照組用PBS代替一抗，僅加二抗,熒光顯微鏡下細胞僅能見藍色細胞核（圖3B）。

圖3 成纖維細胞波形蛋白免疫反應（20×）

3 討論

心房顫動是臨床上最為常見的心律失常之一。研究表明，心房纖維化導致的心房重構是心房顫動發生和持續的重要生理病理機制之一。纖維化表現為心肌成纖維型細胞合成的大量的細胞外基質蛋白的堆積（主要為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原），從而引起心臟的結構重構[4]。心肌成纖維細胞的增殖與轉化是心房發生纖維化的基礎，直接從人心房中獲取的成纖維細胞在研究房顫與心肌纖維化的關系與在動物模型上的研究相比，其臨床價值更高。

目前國內外實驗室體外培養成纖維細胞的技術方法主要包括酶消化法和組織塊貼壁法，前者由于過程復雜，操作繁瑣，且易受胰蛋白酶的濃度，作用時間及溫度等多方面的影響，分離得到的成纖維細胞也易受到心肌細胞的影響，純度不高。傳統的組織塊培養法，未經酶消化，組織塊貼壁困難，心肌成纖維細胞的存活率不高，細胞生長極其緩慢，原代培養耗時長，易引起污染，且細胞生長密度低，不易傳代培養。因此，本研究從多個環節優化組織塊貼壁培養法，貼壁較快，體外培養的成纖維細胞存活率在90%以上，細胞生長密度較高，容易傳代培養。本培養方法的優勢表現在：①為避免組織塊或細胞受到細菌與真菌的污染，在培養基中添加青鏈霉素和兩性霉素B，提高了細胞的存活率；②在前期培養階段，發現普通的DMEM配制的10%胎牛血清，細胞生長緩慢，后將其換成DME/F-12 1∶1（1X），并提高胎牛血清的濃度到20%，細胞生長速度明顯增快，大大縮短了原代培養時間；③優化了組織塊貼壁，Ⅱ型膠原酶特異作用于結締組織的膠原，對膠原和細胞外基質有很好的消化作用，減輕了對細胞的損傷程度[5]。本研究使用0.1%Ⅱ型膠原酶消化組織塊，第一次消化后靜置2 min去除上清液，即將消化下來的膠原蛋白及結締組織去除，使組織塊更易貼壁，培養過程中成纖維細胞更易于從組織塊內遷出。

本研究方法可獲得純度較高的成纖維細胞，該類細胞從形態學特征上看，成纖維細胞呈有突起的梭形或多角形細胞，平行排列或放射狀伸開，界限清楚，與張建成[6]等人培養的人心房成纖維細胞形態相似。波形蛋白（vimentin）是存在于成纖維細胞和胚胎間充質細胞中間絲的主要結構蛋白，主要對細胞核起支持作用，穩定核的位置，與心肌細胞的橋連蛋白有明顯差異，波形蛋白為成纖維細胞的相對特異性標志[7-8]。本實驗中細胞免疫熒光染色顯示波形蛋白強陽性，且純度大于95%，可證實其為成纖維細胞。

本實驗以心臟手術患者右心耳為材料來源，從形態學及細胞免疫熒光檢測波形蛋白兩方面證實了所培養的為心房成纖維細胞，建立了安全、穩定、便捷的人心房成纖維細胞的體外培養方法，為進一步研究心肌纖維化的特點奠定了基礎。

1.Kostin S,Klein G,Szalay Z,et al.Structural correlate of atrial fibrillation in human patients[J].Cardiovasc Res, 2002,54（2）:361-379.

2.Torre C,Jeusette I,Serra M,et al.Bovine colostrum increases proliferation of canine skin fibroblasts[J].J Nutr, 2006,136（7 Suppl）:2058-2060.

3.陳瑞華,趙自剛,牛春雨,等.大鼠肺微血管內皮細胞的培養[J].中國微循環,2007,（01）:16-19.

4.Manabe I,Shindo T,Nagai R.Gene expression in fibroblasts and fibrosis:involvement in cardiac hypertrophy [J].Circ Res,2002,91（12）:1103-13.

5.劉愛軍,靳俊峰.人皮膚成纖維細胞的高效分離培養及鑒定[J].廣東醫學,2008,（12）:1969-1970.

6.張建成,程顯祿,黃宇堅,等.采用組織塊法培養心房顫動患者心房成纖維細胞[J].中國心臟起搏與心電生理雜志,2009,（06）:506-508.

7.Han ZM,Chen DY,Li JS,et al.Flow cytometric cellcycle analysis of cultured fibroblasts from the giant panda, Ailuropoda melanoleuca L[J].Cell Biol Int,2003,27（4）: 349-353.

8.Lyle S,Christofidou-Solomidou M,Liu Y,et al.Human hair follicle bulge cells are biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype[J].J Investig Dermatol Symp Proc,1999,4（3）:296-301.

（2016-01-08收稿）

Isolation and culture of human atrial fibroblasts cells in vitro

Zhou Wei1，Li Miao ling2，Fan Xuehui2，Li Tao2，Wang Xiaoyu2，Yu Fengxu11Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University;2Kgy Laboratory of Medical Electrophysioloy of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province，646000,China

Objective：To establish a reliable method for isolation and culturing of human atrial fibroblasts. Methods：Hu man atrial fibroblasts were cultured by tissue block method in vitro,an inverted phase contrast microscope was used to observe the morphology,and vimentin was immuno-fluorescence stained to identify the fibroblasts.Results：Human atrial fibroblasts were long spindle shaped or polygonal with transparent cytoplasm,2～3 nucleuses,and no spontaneous beating;immuno-fluorescence staining showed positive for vimentin.Conclusion：A stable method of fibroblasts isolation and culturing was established,which provides a reliable source of cells for studying myocardial fibrosis related diseases.

Fibroblast;Cell culture;Cell identification

R541.7+5

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.008

*醫學電生理學教育部重點實驗室開放基金（KeyME-2014-02）；四川省科技廳基金（2011JY0065）資助；瀘州市-西南醫科大學聯合課題（2015LZCYD-S03（3/7）

周偉（1992-），男，碩士生

于風旭（1976-），男，博士，副教授。E-mail：yuluchuan@163.com