懸液芯片技術在實驗兔病原體檢測中的應用

張超超， 黃小燕， 樊海艇， 潘 裕， 趙 源， 黃珍禎， 孫 濤（上海中醫藥大學實驗動物中心， 上海201203）

懸液芯片技術在實驗兔病原體檢測中的應用

張超超， 黃小燕， 樊海艇， 潘 裕， 趙 源， 黃珍禎， 孫 濤
（上海中醫藥大學實驗動物中心， 上海201203）

［編者按：由于生物技術的快速發展，各種檢測技術和手段不斷涌現。實驗動物病原體檢測方法雖然有國家標準規定，但隨著我國的科學研究與國際接軌以及全球化進程，實驗動物病原體檢測需要應用新的技術和手段。本文作者應用懸液芯片技術檢測實驗兔病原體的嘗試，或可為我國實驗動物病原體檢測提供參考。］

目的 應用懸液芯片技術實驗兔幾種病原體的自然感染情況。方法 從8家實驗兔生產單位采購80只實驗兔（7家普通級，1家清潔級），運用懸液芯片技術進行微量、快速、高通量的血清學檢測。結果 各單位實驗兔病原體感染較為普遍，其中輪狀病毒（ROTA）和呼吸道鞭毛桿菌（CARB）的抗體陽性率分別高達72.5%和80%、； 呼腸弧III型病毒（REO-3）、腦胞內原蟲（ECUN）和泰澤氏病原體（CPIL）的抗體陽性率為21.25%、17.5%和10%； 而清潔級實驗兔只存在腦胞內原蟲（ECUN）和泰澤氏病原體（CPIL）的感染，所有動物均不存在淋巴脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）和弓形蟲（TOXO）感染。結論 應用懸液芯片技術可以快速檢測實驗兔病原體。

實驗兔； 懸液芯片技術； 血清學； 病原體

實驗動物質量檢測是保障實驗動物質量的重要技術手段，北京、上海、湖南等地先后做過這方面的調查研究［1-3］。實驗兔作為一種重要的實驗動物，其動物質量尤其是微生物學質量必將影響實驗結果的準確性［4］。實驗動物微生物學質量檢測方法在國家標準中有明確規定，但新技術新方法的應用可為常規檢測提供參考。

懸液芯片技術［5］是一種快速、特異、敏感的檢測新技術［6-8］，該技術具有微量、快速和高通量的特點［9］，作者應用該技術檢測了本地區幾家單位的實驗兔病原體感染情況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗兔由本地區8家擁有實驗動物生產許可證的單位提供， 每家10只， 共80只， 均為雄性， 體質量2.0～2.5 kg。其中1家為清潔級，7家為普通級。

1.2 試劑

多重免疫熒光分析緩沖液（MFIA Assay Buffer）；小牛血清； 防腐劑ProClin300； 初次稀釋液（Primary Diluent）； 磁珠； 兔高免和低免對照液（RbAsmnt High，RbAsmntLow）； 兔輪狀病毒； 兔非免疫對照液（Non-immune Rabbit）； Diluent稀釋液； 抗兔抗體和抗倉鼠IgG（BAG）； 鏈霉親和素（SPE），以上試劑均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.3 儀器及數據處理

Bio-Plex-200懸液芯片系統購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司； 運用Workbook軟件進行數據處理，該軟件由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 血清樣品采集 通過實驗兔耳緣靜脈采集1 mL血液樣本， 3 000 r/min離心15 min， 取血清， 置-20 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 操作過程 制作空白板圖； 每孔加入100 μL多重免疫熒光分析緩沖液濕潤整個測試板，抽濾；每孔加入50 μL微珠； 加入各對照樣本和待測樣本50 μL，用鋁箔包裹， 避光， 置于振蕩器， 600 r/min，60 min，抽濾；每孔加入100 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，抽濾，重復2次； 每孔加入50 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，加入50 μBAG，避光，600 r/min震蕩30 min， 抽濾； 每孔加入100 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，抽濾，重復2次； 每孔加入50 μL多重免疫熒光分析緩沖液， 加入50 μSPE， 避光，600 r/min震蕩30 min， 抽濾； 每孔加入100 μL多重免疫熒光分析緩沖液，抽濾，重復2次； 每孔加入125 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，600 r/min震蕩1 min，底部加膜，放入Bio-Plex讀板。檢測病原體有以下7種： 呼腸弧Ⅲ型病毒（REO-3）、輪狀病毒（ROTA）、淋巴脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）、腦胞內原蟲（ECUN）、泰澤氏病原體（CPIL）、呼吸道鞭毛桿菌（CARB）和弓形蟲（TOXO）。

2 結果

結果表明，各單位實驗兔病原體抗體陽性率的情況較為普遍，其中CARB和ROTA的陽性率為80%和72.5%； REO-3、ECUN和CPIL的陽性率分別為21.25%、17.5%和10%； 未檢出LCMV和T0X0，具體數據詳見表1。

通過表1可看出，其中1家生產單位的實驗兔（清潔級）未檢出CARB和ROTA，只有少數檢出ECUN和CPIL的抗體陽性。

而普通級實驗兔中CARB和ROTA的抗體陽性率達91.4%和72.5%、REO-3、ECUN和CPIL的陽性率分別為21.25%、14.29%和7.14%，而LCMV和弓形蟲TOXO都未見感染。

表1 各單位實驗兔病原體血清學檢測結果

3 討論

實驗兔作為一種重要的實驗動物，是實驗研究中一個必不可少的基礎實驗對象［10］。本次實驗兔采樣范圍的血清學檢測結果表明，實驗兔病原體抗體陽性率較為普遍，其中ROTA和CARB最高，其次REO-3、ECUN和CPIL，但未檢測到LCMV和TOXO感染。清潔級實驗兔沒有檢測到普通級實驗兔存在的主要病原體感染，但還存在ECUN和CPIL的感染［11，12］。說明嚴格的飼養條件是控制實驗動物質量的主要手段，其中陽性率最高的CARB恰恰與實驗動物的飼養環境有關也從側面印證了這點［13］。所以應加強實驗兔的飼養管理，并做好實驗兔病原體監測及預防控制工作。另外，此次檢測的7種病原體中除了CARB，其余6種病原體在我國國家標準中都有列出，但是只有3種為必檢項，是否需要調整必檢項目，有待商榷。

同時， 與傳統的檢測方法相比， 懸液芯片技術體現了微量、快速、高通量的特點［14］。80只實驗兔樣本， 每只動物只需采集1 mL血樣， 同時能對7種病原體進行多重檢測［15］，所有樣本檢測時間只需3～4 h［16］。懸液芯片技術的成熟應用［17］， 可以為實驗兔病原體提供一種新的檢測方法［18］。該項檢測技術在國外已成熟運用于病原體檢測［19-21］。此次檢測用試劑是美國Charles River公司的專利產品， 它是根據美國地區的實驗兔感染特點制定的特殊試劑［22］，其中LCMV和TOXO在此次調查中均未檢出， 其原因有待進一步研究。如果國內能夠開發出適合相應國家標準和我國實驗兔病原體流行情況的專用檢測試劑， 或可促進國內實驗動物病原體檢測技術的發展。

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10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.012

2016-04-01

張超超（1981-）， 男， 實驗師， 從事實驗動物科學及管理。E-mail： stonezcc@163.com

孫 濤（1968-）， 男， 研究員， 研究方向： 病毒與免疫學。E-mail： tao.sun@sjtu.edu.cn