高濃高溫對啤酒酵母發酵性能的影響

周　波，張翠英，陳葉福，石婷婷，劉小二，肖冬光（天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

高濃高溫對啤酒酵母發酵性能的影響

周波，張翠英，陳葉福，石婷婷，劉小二，肖冬光*
（天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

以啤酒酵母S-6為實驗菌株，研究了主發酵溫度和原麥汁濃度對啤酒發酵的殘糖、酒精度、風味物質和絮凝性等性能指標的影響。結果表明，原麥汁濃度一定時，主發酵溫度對高級醇和乙酸酯的含量影響較大，主發酵溫度由10℃提高至16℃時，高級醇含量提高了10%～20%，乙酸酯含量提高了8%～16%，但CO2累積質量損失、殘糖、酒精度和絮凝性基本不受溫度的影響；主發酵溫度一定時，原麥汁濃度對酵母絮凝性影響較大，原麥汁濃度越高，酵母絮凝性越低，將高濃（18°Bx）發酵液稀釋50%至常濃（12°Bx），殘糖、酒精度和高級醇的含量與常濃發酵液基本相同。該研究為選育高溫高濃發酵低產高級醇同時強絮凝性酵母菌株提供了重要依據。

高濃發酵；高溫發酵；高級醇；乙酸酯；絮凝性

啤酒高濃釀造技術由美國和加拿大在20世紀70年代率先推出，現在，北美和北歐的一些國家已將高濃釀造稀釋法作為通常的生產技術，國內高濃釀造技術的應用也越來越廣泛，啤酒行業的競爭也越來越激烈。啤酒高濃釀造是指在啤酒釀造過程中糖化得到較高的麥芽汁濃度（14°P以上），并在發酵后期用飽和的CO2脫氧水稀釋成常規濃度啤酒（10～12°P）的技術。高濃釀造的優點是在不增加糖化、發酵等相關生產設備的基礎上，能夠大大提高企業啤酒的生產能力，減少能源消耗，降低生產成本［1-2］。但是，高濃度的麥芽汁也會給啤酒釀造帶來一系列的問題，如發酵不完全，殘糖量高，發酵周期延長，泡沫穩定性差，啤酒風味不協調等［3-5］。楊小蘭等［6］研究表明，高濃釀造過程中高級醇的生成與接種量、糖漿濃度、α-氨基酸態氮含量有關，18°Bx麥汁發酵的高級醇生成量顯著高于12°Bx麥汁發酵的高級醇生成量。RUSSELI等［7-8］認為高濃麥汁與常濃麥汁相比，其增加的酯水平是成比例的，而ANDERSON R等［4］報道與傳統的麥汁相比，高濃麥汁發酵產生更多的酯類和高級醇，尤其是乙酸乙酯和乙酸異戊酯，但與原麥汁濃度不成比例。高濃釀造對啤酒酵母的影響也很大，主要表現在細胞形態的變化、細胞活性的降低，發酵性能的降低等。啤酒企業最直接的感受則是酵母使用代數降低、絮凝性變差、酵母自溶等［9］。

在主發酵過程中，溫度的控制是至關重要的，主發酵溫度低，麥汁濃度下降慢，發酵時間延長；反之，主發酵溫度高，麥汁濃度下降快，發酵周期縮短。就下面發酵啤酒酵母而言，低溫發酵的溫度控制在7.5～9.0℃，高溫發酵的溫度控制在10～13℃［1，10］。提高主發酵溫度，可以加快酵母的繁殖和發酵，這是對縮短發酵周期有利的方面。但是提高溫度后，酵母的代謝作用發生變化，將產生多量的酯類、高級醇等揮發性物質，嚴重影響啤酒的風味［11］。近年來，關于提高啤酒主發酵溫度方面的研究不多，肖冬光等［12］以啤酒酵母SC-4為出發菌株，經紫外（ultraviolet，UV）誘變育種后獲得一株亮氨酸缺陷型菌株MS-11，此突變株在較高的主發酵溫度（14℃）條件下高級醇生成量為65.35 mg/L，與出發菌株在9℃發酵條件下的高級醇生成量63.24 mg/L基本相當。

本研究以啤酒酵母S-6為出發菌株，通過改變啤酒的發酵工藝條件，研究原麥汁濃度和主發酵溫度對啤酒酵母發酵性能的影響，為下一步選育適于高濃高溫發酵的啤酒酵母提供重要的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

下面發酵工業啤酒酵母菌株S-6（Saccharomyces cerevisiae）：天津科技大學工業微生物教育部重點實驗室保存。

1.1.2培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：1%酵母提取物，2%葡萄糖，2%蛋白胨，pH6.0，121℃滅菌20 min。

麥芽汁培養基：稱量一定量粉碎的麥芽，按1∶4（g∶mL）的料水比糖化至碘檢完畢，通過蒸發濃縮的方式制得18°Bx高濃麥汁，再利用糖度計調整外觀糖度至12°Bx，制得常濃麥汁，115℃、0.1 MPa滅菌20 min。種子培養基和發酵培養基均使用麥芽汁培養基。

以上培養基各組分配比均為質量體積比（g∶mL），固體培養基需加2%瓊脂。

1.2儀器與設備

ZXJD-A1270恒溫培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；25mL附溫比重瓶：安徽省鳳陽縣玻璃廠；50mL具塞比色管：濟寧佰一化工有限公司；UV-5200型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；7890A型氣相色譜儀：美國安捷倫科技公司。

1.3方法

1.3.1不同發酵工藝的確定

4種不同的發酵工藝條件，分別為①常濃常溫（12°Bx、10℃）、②常濃高溫（12°Bx、16℃）、③高濃常溫（18°Bx、10℃）、④高濃高溫（18°Bx、16℃）。

1.3.2啤酒發酵過程

菌種活化：保存菌種轉接至YEPD斜面試管30℃活化培養2 d。

一級種子培養：取斜面菌種一環，接種于裝有5 mL麥汁的試管中，28℃靜置培養24 h。

二級種子培養：一級種子液按10%的接種量接入盛有50 mL麥汁的150 mL三角瓶內，16℃靜置培養36 h。

啤酒發酵：二級種子液經過離心得到酵母泥，酵母泥按0.5%的接種量接入盛有150 mL麥汁的250 mL三角瓶內，靜置發酵10～14d。發酵結束后測定CO2累積質量損失、酒精度、殘糖、風味物質和酵母絮凝性等啤酒指標和酵母發酵性能。

1.3.3測定方法

CO2質量損失測定：發酵前預先稱量發酵體系總質量，發酵過程中每隔12 h稱質量一次，稱質量前應先搖晃三角瓶，以去除發酵液中的CO2，當質量損失＜0.1 g時，表示發酵基本結束。

殘糖、酒精度和發酵度的測定：酒精度和發酵度依據啤酒分析方法進行測定［13］；利用斐林試劑法測定發酵結束后的殘糖［14］。

揮發性風味物質的測定：啤酒發酵液經蒸餾后采用氣相色譜法測定［15］。

（1）色譜條件

毛細管色譜柱（19091N-213）：30 m×320 μm×0.5 μm；柱溫：75℃；進樣室溫度：200℃；火焰離子檢測器溫度：230℃；H2：30 mL/min，N2：20 mL/min，空氣：400 mL/min；隔吹掃流量：3 mL/min，分流比：20∶1；進樣量：1 μL。

（2）試樣前處理

發酵結束后，通過蒸餾發酵液得到酒樣，取內標液（乙酸正丁酯）0.1 mL，并用上述酒樣定容至10 mL，得酒樣稀釋液。

（3）分析方法

進樣需要檢測的高級醇和酯類標準樣品溶液，測得各物質保留時間。再進酒樣稀釋液，根據各物質的保留時間初步定性各物質，根據各組分峰面積用內標法定量計算各組分含量。

酵母絮凝性的測定方法：光密度改良法測定酵母絮凝性［16］。

2　結果與分析

2.1不同發酵工藝條件對發酵速度的影響

圖1　不同發酵工藝條件對發酵速度的影響Fig.1 Effects of different fermentation conditions on fermentation rate

按照1.3.2的方法進行發酵，12 h測量一次CO2質量損失，以發酵時間為橫坐標，CO2的累積質量損失為縱坐標繪制CO2的累積質量損失曲線，4種發酵工藝對啤酒發酵速度的影響，結果見圖1。由圖1可知，原麥汁濃度為12°Bx或18°Bx時，高溫發酵（16℃）比常溫發酵（10℃）的發酵周期都縮短了3 d，說明當原麥汁濃度相同時，主發酵溫度對發酵速度影響較大，主發酵溫度越高，發酵速度越快，發酵周期越短，但是，同一原麥汁濃度條件下的不同主發酵溫度對CO2的累積質量損失基本沒有影響。主發酵溫度為10℃時，高濃（18°Bx）發酵的CO2的累積質量損失是常濃（12°Bx）發酵的1.43倍；主發酵溫度為16℃時，高濃發酵的CO2的累積質量損失是常濃發酵的1.5倍，說明當主發酵溫度相同時，18°Bx和12°Bx麥汁發酵后的CO2累積質量損失變化比例符合濃度變化的比例。

2.2不同發酵工藝條件對發酵性能的影響

將啤酒酵母菌株S-6按照4種不同的發酵工藝進行發酵，發酵結束后測定發酵液的殘糖、酒精度和發酵度，結果見表1。由表1可知，原麥汁濃度為12°Bx，主發酵溫度為10℃時，殘糖、酒精度和發酵度分別為（0.60±0.02）g/100mL、（4.54±0.12）%vol和（71.23±0.82）%，原麥汁濃度為12°Bx、主發酵溫度為16℃時，殘糖、酒精度和發酵度分別為（0.65±0.02）g/100 mL、（4.50±0.05）%vol和（72.48±0.34）%，通過SPSS軟件進行顯著性分析，當原麥汁濃度相同時，不同主發酵溫度條件下測得的殘糖、酒精度和發酵度沒有顯著性差異，說明原麥汁濃度相同時，主發酵溫度對殘糖、酒精度和發酵度等主要發酵性能沒有影響。用高濃麥汁（18 °Bx）發酵時，可以得出上述相同的結論。

比較相同主發酵溫度條件下的不同原麥汁濃度發酵后的殘糖、酒精度發現，隨著原麥汁濃度的提高，殘糖和酒精度都有所升高。主發酵溫度為10℃時，用12°Bx麥汁發酵的殘糖為0.60 g/100 mL，用18°Bx麥汁發酵的殘糖為0.95 g/100 mL，較12°Bx麥汁發酵的殘糖提高了0.58倍，接近于原麥汁濃度提高的倍數，同樣地，18°Bx麥汁發酵的酒精度較12°Bx麥汁發酵的酒精度提高了0.53倍。上述結果表明，18°Bx和12°Bx麥汁發酵后的殘糖和酒精度含量變化的倍數基本符合麥汁濃度變化的倍數，即將18°Bx麥汁的發酵液稀釋50%后可達到常濃麥汁的酒精度和殘糖量。

發酵度反映了酵母對糖類的發酵情況，有些酵母不能或較少地發酵麥芽三糖，表現為低發酵度；有些酵母能發酵麥芽四糖或異麥芽糖，表現為高發酵度［17］。從表1可以看出，不同的發酵條件對啤酒的發酵度影響不大，四種發酵工藝條件下的啤酒發酵度都處于較高的水平。

2.3不同發酵工藝對高級醇和乙酸酯含量的影響

發酵結束后，對發酵液進行蒸餾，獲得待測酒樣，采用氣相色譜法測定酵母菌株S-6在不同發酵工藝條件下發酵液中高級醇和乙酸酯的含量，結果見表2。

表1　不同發酵工藝條件對發酵性能的影響Table 1 Effects of different fermentation conditions on fermentation performance

表2　不同發酵工藝條件高級醇和乙酸酯含量的比較Table 2 Comparison of higher alcohols and acetic esters production under different fermentation conditions mg/L

從表2可以看出，發酵工藝條件的不同對總高級醇和總乙酸酯的影響較大，原麥汁濃度為12°Bx時，16℃發酵產生的總高級醇含量比10℃發酵時提高了14.0%，總乙酸酯的含量提高了16.2%；原麥汁濃度為18°Bx時，16℃發酵產生的總高級醇含量比10℃發酵時提高了13.0%，總乙酸酯的含量提高了8.0%。在相同的原麥汁濃度條件下，經SPSS軟件分析，不同主發酵溫度生成的總高級醇和總乙酸酯有顯著性差異，主發酵溫度越高，總高級醇和總乙酸酯的含量越高。當發酵溫度相同時，原麥汁濃度越高，發酵液中總高級醇和總乙酸酯的含量越高。但將高濃（18°Bx）發酵液稀釋50%達到常濃（12°Bx），此時總高級醇含量與常濃發酵液的總高級醇含量基本相同，說明總高級醇的含量是與原麥汁濃度的提高基本成比例的。但是，總乙酸酯的含量與原麥汁濃度的提高不成比例，高濃度稀釋啤酒較同濃度發酵的啤酒含有較多的酯類。

2.4不同發酵工藝條件對酵母絮凝性的影響

發酵結束后，發酵液經過離心、洗滌等步驟獲得酵母泥，按照1.3.3方法測定酵母的絮凝性，結果見表3。

表3　不同發酵工藝條件對酵母絮凝性的影響Table 3 Effects of different fermentation conditions on yeast flocculation

酵母絮凝性是啤酒酵母的一個重要特性，絮凝性的強弱不僅對啤酒的發酵周期、過濾性能等生產過程控制具有重要意義，而且會影響到啤酒的風味，在生產上具有特殊的意義，也是區別酵母菌株的一項重要內容［18］。由表3可以看出，不同的發酵工藝條件對酵母絮凝性的影響不同。通過SPSS軟件進行顯著性分析，主發酵溫度相同時，不同原麥汁濃度對酵母絮凝性有顯著影響（P＜0.05），主發酵溫度為10℃時，18°Bx麥汁發酵的酵母絮凝性較12°Bx麥汁發酵的酵母絮凝性降低了10.4%，而主發酵溫度為16℃時，18°Bx麥汁發酵的酵母絮凝性較12°Bx麥汁發酵的酵母絮凝性降低了12.5%。但是，同一主發酵溫度條件下的不同原麥汁濃度對酵母的絮凝性影響不大。結果表明，主發酵溫度對酵母絮凝性的影響沒有原麥汁濃度對酵母絮凝性的影響大，原麥汁濃度越高，酵母的絮凝性越低。

3　結論

本實驗研究了原麥汁濃度和主發酵溫度對啤酒發酵各項性能指標的影響。研究結果表明，主發酵溫度不僅影響啤酒發酵的速度，還影響啤酒中風味物質的含量。主發酵溫度由10℃升至16℃，高級醇含量提高了10%～20%，乙酸酯含量提高了8%～16%。而且主發酵溫度對CO2的累積質量損失、殘糖、酒精度和絮凝性的影響不大；原麥汁濃度越高，酵母的絮凝性越低，但殘糖、酒精度和高級醇的含量與原麥汁濃度的提高基本成比例。

高溫發酵通過選育低產高級醇的啤酒酵母菌株能夠降低啤酒中的高級醇含量，改善啤酒的風味。高濃發酵通過選育強絮凝性的啤酒酵母，在啤酒發酵后期酵母能夠及時地沉降到發酵罐的底部，便于過濾［19-20］。綜上所述，選育出一株高溫高濃發酵低產高級醇同時強絮凝性的酵母菌株，既可以使啤酒的風味保持在合理的閾值范圍內，又可以達到節約能耗，降低生產成本的目的。

［1］管敦儀.啤酒工業手冊［M］.北京：中國輕工業出版社，1998.

［2］李洪亮.啤酒生產企業節能措施綜述［J］.中國釀造，2013，32（5）：145-147.

［3］CASEY G P，MAGNUS C A.High-gravity brewing∶effects of nutrition on yeast composition，fermentative ability，and alcohol production［J］. Appl Environ Microbiol，1984，48（3）∶639-646.

［4］ANDERSON R G，KIMOP B H.Quantitative aspects of the control of oxygenation and acetate ester concentration in beer obtained from high gravity wort［J］.J I Brewing，1975，81（4）∶296-301.

［5］COOPER D J，STEWART G G，BRYCE J H.Hydrophobic polypeptide extraction during high gravity mashing experimental approaches for its improvement［J］.J I Brewing，1998，104（5）∶283-287.

［6］楊小蘭，羅正明，胡仕屏，等.降低高濃啤酒發酵中高級醇含量的研究［J］.食品科學，2011，32（9）：188-191.

［7］RUSSEL I，STEWART G G.Brewing［J］.Biotechnology，1995（9）∶419-462.

［8］REES E M R，STEWART G G.The effects of increased magnesium and calcium concentrations on yeast fermentation performance in high gravity worts［J］.J I Brewing，1997，103（5）∶287-291.

［9］郭立蕓.18°P高濃釀造抗葡萄糖阻遏效應啤酒酵母的選育［J］.食品與發酵工業，2015（4）：91-96.

［10］崔云前.微型啤酒釀造技術［M］.北京：化學工業出版社，2008.

［11］SAERENS S M，VERBELEN P J，VANBENEDEN N，et al.Monitoring the influence of high-gravity brewing and fermentation temperature on flavour formation by analysis of gene expression levels in brewing yeast［J］.Appl Environ Microbiol，2008，80（6）∶1039-1051.

［12］肖冬光，韓濤，李家飚.低產雜醇油啤酒酵母菌株的選育［J］.釀酒科技，2005（4）：31-33.

［13］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 4928—2008啤酒分析方法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［14］蔡定域.釀酒工業分析手冊［M］.北京：輕工業出版社，1988.

［15］佐一含，朱旭東，陳葉福，等.LEU2基因敲除對工業啤酒酵母高級醇生成量的影響［J］.中國釀造，2011，30（3）：27-30.

［16］吳英敏，王德良，張彥青，等.激光-氯化鋰復合誘變選育絮凝性適中的啤酒酵母［J］.釀酒，2007，34（2）：81-83.

［17］畢德成，張道雷，郭東波.工業生產中啤酒發酵度影響因素的研究［J］.中國釀造，2012，31（12）：116-118.

［18］王衛國，張仟偉，趙永亮，等.釀酒酵母的選育及其應用研究進展［J］.河南工業大學學報：自然科學版，2015（6）：104-112.

［19］TOFALO R，PERPETUINI G，DI GIANVITO P，et al.Genetic diversity ofFLO1andFLO5genes in wine flocculentSaccharomyces cerevisiae strains［J］.Int J Food Microbiol，2014，191∶45-52.

［20］GOVENDER P，DOMINGO J L，BESTER M C，et al.Controlled expression of the dominant flocculation genesFLO1，FLO5，andFLO11 inSaccharomyces cerevisiae［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（19）∶6041-6052.

Effects of high gravity and high temperature on fermentation performance of beer yeast

ZHOU Bo，ZHANG Cuiying，CHEN Yefu，SHI Tingting，LIU Xiaoer，XIAO Dongguang*
（KeyLab ofIndustrial FermentingMicrobiology，MinistryofEducation，College ofBioengineering，Tianjin UniversityofScience and Technology，Tianjin 300457，China）

Using beer yeast S-6 as experimental strain，the effects of main fermentation temperature and initial wort gravity on alcohol content，flavor substance，flocculability and other fermentation characters by beer yeast S-6 were studied.The results showed that under certain initial wort gravity，the main fermentation temperature had great effects on higher alcohols and acetic esters.When the main fermentation temperature increased from 10℃to 16℃，higher alcohols content increased 10%to 20%，acetic esters increased 8%to 16%，but no effects on total loss of CO2，residual sugar，alcohol content and flocculability.In addition，the initial wort gravity had great effects on flocculability under certain main fermentation temperature；the original wort concentration was higher，while the flocculability of beer yeast was lower.When the high-gravity fermentation broth（18°Bx）was diluted50%totheconventionalgravity（12°Bx），therewasnosignificantdifferencesinresidualsugar，alcoholcontentandhigheralcoholswithcommon fermentation broth.The research provided an important basis for breeding a low-yielding higher alcohols and strong flocculability beer yeast under high temperature and high gravity fermentation process.

high gravity fermentation；high temperature fermentation；higher alcohols；acetic esters；flocculability

Q815；TS261.4；TS262.5

0254-5071（2016）02-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.003

2015-12-02

國家自然科學基金資助項目（31271916）

周波（1988-），男，碩士研究生，研究方向為現代釀造技術。

肖冬光（1956-），男，教授，博士，研究方向為現代釀造技術。