朱欽豪,邊亞西,吳 昊,梁智群,陳桂光,曾 偉*(1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530004;2.廣西大學(xué) 微生物及植物遺傳工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530004;3.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530004)
淡紫灰鏈霉菌H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化
朱欽豪1,2,3,邊亞西1,2,3,吳昊1,2,3,梁智群1,2,3,陳桂光1,2,3,曾偉1,2,3*
(1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530004;2.廣西大學(xué) 微生物及植物遺傳工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530004;3.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530004)
采用響應(yīng)面的方法對(duì)淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對(duì)產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑影響較為顯著的3個(gè)因素:初始pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間,利用最陡爬坡試驗(yàn)確定Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn),然后進(jìn)行中心組合試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳發(fā)酵條件為初始pH值為6.5、發(fā)酵時(shí)間4 d、接種量9%,經(jīng)過(guò)3次試驗(yàn)驗(yàn)證,該發(fā)酵液抑制率穩(wěn)定在68.79%,與預(yù)測(cè)值相接近。
α-葡萄糖苷酶抑制劑;淡紫灰鏈霉菌;響應(yīng)面法;降血糖作用
糖尿病是一種由于缺乏胰島素或者胰島素活性喪失而導(dǎo)致的一種慢性代謝性疾?。?],可分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病,糖尿病患者數(shù)量已相當(dāng)驚人,并有每年遞增的趨勢(shì)[2-4],其中Ⅱ型糖尿病占大多數(shù)。有研究表明,通過(guò)控制小腸中的α-葡萄糖苷酶活性可以有效的改善糖尿病人的血糖情況[5,6]。
α-葡萄糖苷酶抑制劑目前是臨床上治療Ⅱ型糖尿病的一線口服降糖藥物,它通過(guò)可逆性的抑制腸道內(nèi)的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶(如α-蔗糖酶等),能分別延緩淀粉和多糖的分解,從而降低血糖[5-6]。目前臨床上用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要有阿卡波糖[7]、米格列醇[8]以及一些中藥[9]等。桑葉在古代即被中醫(yī)用于治病,在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)桑葉中含有α-葡萄糖苷酶抑制劑黃酮類[10]等物質(zhì),在降血糖以及治療肥胖方面均有應(yīng)用[11-12];據(jù)報(bào)道,植物來(lái)源的活性物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用[6,13];但植物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的含量比較少,且受時(shí)間和地域的影響較大,而微生物來(lái)源的α-葡萄糖苷酶抑制劑不存在這樣的局限性,微生物源的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要來(lái)源于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)[14]、淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)[15]和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[16]。本實(shí)驗(yàn)室從海洋中篩選得到一株產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)菌株,但α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)量較低仍需進(jìn)一步提高。
響應(yīng)面法優(yōu)化是微生物發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中常用的一種常用的優(yōu)化方法,陳艷娟等[17]在α-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化中利用響應(yīng)面的方法使發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶的酶活提高了35%左右;齊西珍等[18]在α-葡萄糖苷酶抑制劑發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化過(guò)程中,利用響應(yīng)面優(yōu)化的方式使發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶抑制劑含量較優(yōu)化前提高了668倍,響應(yīng)面法在桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑提取應(yīng)用中使其產(chǎn)量也有所提高[19-20]。本研究擬采用響應(yīng)面的方式對(duì)淡紫灰鏈霉菌H2進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化,以提高發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶抑制劑的含量,為發(fā)酵罐培養(yǎng)菌株產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑提供一定的技術(shù)支持,以便于大規(guī)模量產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑。
1.1材料與試劑
1.1.1試驗(yàn)材料
淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)菌株H2由作者實(shí)驗(yàn)室保藏,菌株H2來(lái)自于廣西北海。
1.1.2試劑
4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG):美國(guó)Aladdin公司;α-葡萄糖苷酶(15 000 U):美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.1.3培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉2%,KNO30.1%,NaCl 0.05%,K2HPO40.05%,MgSO40.05%,瓊脂2%,pH 7.2~7.4,121℃滅菌20 min。
原始發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉4%,黃豆粕粉2%,(NH4)2CO30.06%,NaCl 0.05%,K2HPO40.05%,MgSO40.05%,pH 7.0,121℃滅菌20 min。
優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基:糊精4%,玉米漿干粉1.5%,NaCl 0.05%,K2HPO40.05%,MgSO40.05%,pH 6.5,121℃滅菌20 min。
1.2儀器與設(shè)備
YP1200型電子天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國(guó)華電器有限公司;J2-21高速冷凍離心機(jī):美國(guó)Beckman公司;UVmini-1240紫外分光光度計(jì):日本島津公司;DSW-CJ-1F超凈工作臺(tái):蘇州泰安科技有限公司。
1.3方法
1.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定方法[21]

表1 PNPG法測(cè)定發(fā)酵液抑制率Table 1 The inhibition rate of fermentation liquid by PNPG
α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定采用PNPG法。發(fā)酵結(jié)束后,提取一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基,于4℃、10 000 r/min離心1 min,吸取上清稀釋50倍,在波長(zhǎng)405 nm條件下測(cè)定吸光度值,測(cè)定方法見表1。計(jì)算出發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.2單因素試驗(yàn)
以α-葡萄糖苷酶抑制率為考察指標(biāo),分別對(duì)碳源、氮源、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH、接種量、種齡、發(fā)酵時(shí)間等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),確定最佳單因素試驗(yàn)條件。
1.3.3響應(yīng)面試驗(yàn)
(1)Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
選擇N=12的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察糊精(A)、玉米漿干粉(B)、初始pH(D)、裝液量(F)、接種量(H)、發(fā)酵時(shí)間(K)、種齡(L)7個(gè)因素對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)抑制劑的影響的大小,每個(gè)因素取兩個(gè)水平,即低水平和高水平,以抑制率(Y)作為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)分析,通過(guò)對(duì)比各因素顯著性,篩選出對(duì)抑制劑產(chǎn)率較大的因素。
(2)最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)PB試驗(yàn)分析得到3個(gè)顯著性因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),最陡爬坡方向以PB試驗(yàn)值正負(fù)效應(yīng)為爬坡方向,以PB試驗(yàn)中的步長(zhǎng)為來(lái)確定最陡爬坡的步長(zhǎng),其余不顯著因素取最佳水平,從而確定最佳的產(chǎn)酶抑制率區(qū)域。
(3)中心組合(BB)試驗(yàn)
根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果確定3因素3水平的中心組合試驗(yàn),通過(guò)Design-Expert8.0.6進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)共有17組試驗(yàn),最后根據(jù)軟件分析得出最優(yōu)的試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行驗(yàn)證,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。
2.1單因素試驗(yàn)
2.1.1不同碳源和最適碳源濃度對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖1 不同碳源對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulaeH2
在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加40 g/L的不同碳源,由圖1可知,以糊精為碳源時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高,因此選用糊精為最佳碳源;由圖2可知,糊精質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí),發(fā)酵液抑制率達(dá)到最大值。因此,選擇質(zhì)量濃度40 g/L糊精為最適碳源。

圖2 糊精質(zhì)量濃度對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.2 Effect of different dextrin concentration on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2
2.1.2不同氮源及最適氮源濃度對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖3 不同氮源對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2

圖4 玉米漿干粉質(zhì)量濃度對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.4 Effect of different corn steep dry powder concentration on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2
由圖3可知,當(dāng)硝酸銨作為氮源時(shí),抑制率不足15%;在添加量均為20 g/L時(shí),玉米漿干粉和蛋白胨抑制率相當(dāng),但考慮到經(jīng)濟(jì)成本,本研究擬選用玉米漿干粉作為最適氮源。由圖4可知,在玉米漿干粉添加量為20 g/L時(shí)發(fā)酵液的抑制率達(dá)到最大值,故選擇質(zhì)量濃度玉米漿干粉20 g/L為最佳氮源質(zhì)量濃度。
2.1.3裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖5 不同裝液量(A)和搖床轉(zhuǎn)速(B)對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.5 Effect of different liquid volume(A)and rotate speed(B)on α-glucosidase inhibitor production with S.lavendulae H2
由圖5A可知,隨著裝液量的增加,發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力逐漸增加,在裝液量為50 mL/250 mL時(shí)達(dá)到最大值,因此50 mL/250 mL為最佳裝液量。由圖5B可知,搖床轉(zhuǎn)速在180 r/min和200 r/min時(shí)發(fā)酵液抑制能力相當(dāng),在其他搖床轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵液抑制率均有所下降,考慮到設(shè)備能源消耗,本研究擬采用較低轉(zhuǎn)速作為最佳轉(zhuǎn)速,即選擇180 r/min為后續(xù)發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速。
2.1.4溫度和初始pH對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響
由圖6A可知,發(fā)酵液的抑制率隨著溫度的升高先升高后降低,在28℃達(dá)到最大值,因此選擇28℃為最適培養(yǎng)溫度。由圖6B可知,初始pH值為10.0時(shí),發(fā)酵液抑制率為0,在發(fā)酵液初始pH為7.0時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活力達(dá)到最大,選擇最適初始pH值為7.0。

圖6 不同溫度(A)和初始pH(B)對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.6 Effect of different temperature(A)and initial pH(B)on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2
2.1.5接種量、種齡對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖7 不同接種量(A)和種齡(B)對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.7 Effect of different inoculum(A)and seed age(B)on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2
由圖7A可知,接種量在8%時(shí)抑制率達(dá)到最大值;由圖7B可知,在種齡較小時(shí)接種,菌體量較少,接種后會(huì)有較長(zhǎng)的停滯期,在種齡較大時(shí),由于菌體即將進(jìn)入穩(wěn)定期也不利于發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的應(yīng)用,種齡在24 h時(shí)(此時(shí)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)抑制率達(dá)到最大。選用接種量為8%,種齡為24 h最佳。
2.1.6發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2
由圖8可知,在接種后2 d發(fā)酵液的抑制率即達(dá)到45%左右,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,發(fā)酵液的抑制率不斷增加,在第4天到最大值,其后隨著時(shí)間的增加,還有減小的趨勢(shì),由于菌株培養(yǎng)3 d和培養(yǎng)4 d發(fā)酵液抑制率差別不大,為提高設(shè)備利用效率,采用培養(yǎng)時(shí)間3 d為最佳。
2.2 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,得到各因素的最佳試驗(yàn)值,根據(jù)此結(jié)果設(shè)計(jì)PB試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments
由表3可知,其中模型的P值為0.020 8<0.05,表明該模型顯著,影響菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑顯著性因素的排序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間>初始pH>接種量,其中發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)結(jié)果有正效應(yīng)影響,初始pH值為負(fù)效應(yīng)影響,按Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的正負(fù)效應(yīng)進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results
2.3最陡爬坡試驗(yàn)

表4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the steepest ascent experiments
由Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)出最陡爬坡試驗(yàn)方案,按照一定的步長(zhǎng)確定試驗(yàn)設(shè)計(jì),其設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4。由表4可知,其中第3組試驗(yàn)具有最高的α-葡萄糖苷酶抑制率,即初始pH值為6.5,發(fā)酵時(shí)間為4 d,接種量為10%,在之后的BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)中以此條件作為中心點(diǎn),其他試驗(yàn)條件不變。
2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
2.4.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析
根據(jù)響應(yīng)面最佳中心點(diǎn)設(shè)計(jì)BB中心組合試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5,BB試驗(yàn)方差分析見表6。
由Box-Behnken試驗(yàn)方差分析結(jié)果可知,模型的P值<0.000 1,模型高度顯著。該模型的擬合方程為Y=70.05-2.38A-1.09B+1.13C+0.75AB+0.58AC+2.12BC-6.62A2-4.67B2-8.22C2,回歸方程的決定系數(shù)R2為0.980 8,修正系數(shù)RAdj2為0.956 0,變異系數(shù)為2.31%,信噪比為17.516,失擬項(xiàng)P值為0.1608>0.05,表明失擬項(xiàng)不顯著;說(shuō)明該擬合方程可以用于H2菌株產(chǎn)抑制劑的分析和預(yù)測(cè)。
利用Design-Expert軟件對(duì)BB試驗(yàn)組進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到響應(yīng)面立體分析結(jié)果見圖9。由圖9可知,初始pH和發(fā)酵時(shí)間響應(yīng)面曲線較為陡峭,說(shuō)明初始pH和發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑制劑產(chǎn)量的影響較為明顯,在發(fā)酵時(shí)間不變的情況下,隨著初始pH增加,發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率先增加后減少;在初始pH不變的情況下,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率先升后降。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the Box-Behnken experiments

表6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiments results

圖9 初始pH、接種量和發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)抑制率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,inoculum and fermentation time on inhibition rate
2.4.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)與驗(yàn)證
通過(guò)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析,該模型對(duì)這三個(gè)因素的預(yù)測(cè)值分別為初始pH值6.44,接種量8.82%,發(fā)酵時(shí)間4.02 d,響應(yīng)值達(dá)到最大,即抑制率為70.32%,基于實(shí)際操作的可行性,將預(yù)測(cè)值做以下調(diào)整:初始pH值為6.5,接種量為9%,發(fā)酵時(shí)間為4 d。在此條件下對(duì)結(jié)果進(jìn)行3次平行驗(yàn)證,最終測(cè)得的抑制率為68.79%,與理論值相對(duì)誤差為2.17%,該結(jié)果表明回歸方程能較好的預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)值,即該響應(yīng)面對(duì)菌株H2的發(fā)酵條件的優(yōu)化準(zhǔn)確可行。
通過(guò)單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman(PB)試驗(yàn),篩選出對(duì)海洋源淡紫灰鏈霉菌H2液體發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的3個(gè)主要因素,并經(jīng)過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)逼近抑制劑產(chǎn)量最大區(qū)域的3個(gè)水平,再利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)其進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出菌株H2的最佳發(fā)酵條件組合為:初始pH值6.5、發(fā)酵時(shí)間4 d、接種量9%,經(jīng)過(guò)3次試驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)酵液的抑制率達(dá)到68.79%,與預(yù)測(cè)值(發(fā)酵液抑制率70.32%)比較接近,表明該優(yōu)化結(jié)果可靠;在此條件下α-葡萄糖苷酶抑制率比在初始培養(yǎng)條件下提高了14.46%。
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Optimization of fermentation conditions for α-glucosidase inhibitor production by Streptomyces lavendulae H2
ZHU Qinhao1,2,3,BIAN Yaxi1,2,3,WU Hao1,2,3,LIANG Zhiqun1,2,3,CHEN Guiguang1,2,3,ZENG Wei1,2,3*
(1.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.Key Laboratory of Ministry of Education for Microbial and Plant Genetic Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China;3.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530004,China)
The fermentation conditions of α-glucosidase inhibitor production withStreptomyces lavendulaeH2 were optimized by response surface methodology.Three factors which had significant effect on α-glucosidase inhibitor production were determined as initial pH,inoculum and fermentation time by single factor experiment and Plackett-Burman design.The central point of Box-Behnken central composite design was determined by the steepest ascent experiments,and then the fermentation conditions were optimized.The optimum fermentation conditions were as follows∶initial pH 6.5,fermentation time 4 d and inoculum 9%.Through three validation tests,the inhibition rate of fermented liquid was in steady at 68.79%,which was approached with predicted value.
α-glucosidase inhibitor;Streptomyces lavendulae;response surface methodology;hypoglycemic activity
Q815
0254-5071(2016)02-0018-06
10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.005
2015-12-13
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31560448,21506039);廣西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015GXNSFBA139052)
朱欽豪(1990-),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工程。
曾偉(1987-),男,助理研究員,博士,研究方向?yàn)楣I(yè)微生物的發(fā)酵工藝,代謝調(diào)控及生物制品開發(fā)應(yīng)用。