小球藻Chlorellasp.的小分子有機酸/醇培養研究

黃達明，孔　苗，霍書豪*，錢靜亞，徐　玲，杜卓蓉，周衛征，崔鳳杰，鄒　彬（.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 03；.中國科學院可再生能源重點實驗室，中國科學院廣州能源研究所，廣東 廣州 50640）

小球藻Chlorellasp.的小分子有機酸/醇培養研究

黃達明1，孔苗1，霍書豪1*，錢靜亞1，徐玲1，杜卓蓉1，周衛征2，崔鳳杰1，鄒彬1
（1.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.中國科學院可再生能源重點實驗室，中國科學院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640）

該研究選擇一株對水解酸化液耐受性強、高產油脂的優良藻株Chlorellasp.作為出發藻株，向BG11培養基中分別添加不同質量濃度小分子有機酸/醇（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和乙醇）進行小球藻純培養試驗。在單因素試驗的基礎上，混合乙酸、丙酸、丁酸和乙醇4種小分子有機物質進行響應面的試驗，考察混合小分子有機酸對小球藻Chlorellasp.生長影響，研究表明，當乙酸、丙酸、丁酸和乙醇的質量濃度分別為1.02 g/L、0.42 g/L、0.40 g/L和0.18 g/L時，小球藻的單位體積細胞數含量最高，生長狀態最好，能獲得較高的生物量（1.18×108CFU/mL）。

小分子有機酸/醇；小球藻；生物量

小球藻因為其極高的營養價值通常被作為一種優質的綠色營養食品。其主要營養成分甚至優于部分日常主要食品，具有高蛋白、低脂肪、低糖、礦物質元素含量豐富的優點，并且具有某些特殊醫療保健功能［1］。但目前來看，小球藻的培養成本很高。

某些較高懸浮固體的有機廢水（如釀造廢水），通過水解酸化處理，廢水生物降解性能可以得到改善，懸浮物得到有效去除后，可以用作一些小球藻的培養基質［2-5］。李硼飛等［6］通過分析測試得知，小球藻很容易利用小分子有機酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸。LIU C H等［7］利用與水解酸化液成分相近的丁酸梭菌發酵上清液培養普通小球藻Chlorella vulgarisESP6，發現該小球藻可以在4倍稀釋的發酵上清液中生長，其中，乙酸可以被小球藻高效利用。WEN Q等［8］利用剩余污泥厭氧水解酸化液流出物進行蛋白核小球藻Chlorella protothecoides培養，證實小球藻可以利用乙酸，丁酸和少量的丙酸作為碳源生長。

本試驗選擇一株對水解酸化液耐受性強、高產油脂的優良藻株Chlorellasp.作為出發藻株，首先向小球藻培養基BG11中分別添加不同濃度小分子有機酸（如乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和乙醇）進行小球藻純培養［4-5］。然后在單因素試驗的基礎上混合乙酸、丙酸、丁酸和乙醇4種物質進行響應面的設計，考察混合小分子有機酸/醇對小球藻生長影響。本研究的目的是提高小球藻生物量，為獲得較高濃度的微藻生物質提供科學參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

小球藻Chlorellasp.：江蘇大學食品與生物工程學院實驗室保藏；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乙醇、異戊酸、異丁酸等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

BG11培養基：NaNO31.5g/L，K2HPO40.4g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，CaCl2·7H2O0.36g/L，Na2CO30.2g/L，檸檬酸0.06 g/L，檸檬酸鐵0.06g/L，Na2EDTA·H2O0.01g/L，蒸餾水1000mL，微量元素溶液A5 1 mL/L。

微量元素溶液A5：H3BO42.86g/L，MnCl2·4H2O1.86 g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，Na2MoO4·2H2O0.021g/L，CuSO4·5H2O 0.08 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g/L。

1.2儀器與設備

XB-K-25血球計數板：上海求精生化儀器有限公司；PH-3C型便攜式PH計：上海三信儀表廠；H-1850R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ZC-2102GZ光照恒溫搖床：常州中誠儀器制造有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1小球藻Chlorellasp.的培養

小球藻Chlorellasp.采用BG11培養基在光照搖床內進行無菌培養。培養溫度（25±1）℃，轉速150 r/min，光照強度為（50±10）μmol/（m2·s）。選取對數期的藻種接種，接種量10%。在BG11培養基中分別添加一定濃度梯度的乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸，并調節最終pH值為7.0［9］。考察向BG11培養基中添加不同劑量的小分子有機酸對小球藻Chlorellasp.生物量的影響。

1.3.2藻細胞計數［10-11］

藻細胞計數利用血球計數板進行計數。

1.3.3小分子有機酸/醇小球藻純培養單因素試驗

配制新鮮的BG11培養基，并按照釀醋廢水水解酸化液的特點向其中分別加入一定量的乙酸、乙醇、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸，使乙酸的質量濃度梯度為0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.2 g/L；使丙酸的質量濃度梯度為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L；使丁酸的質量濃度梯度為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L；使異丁酸的質量濃度梯度為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L；使戊酸的質量濃度梯度為0、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L；使異戊酸的質量濃度梯度為0、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L；使乙醇的質量濃度梯度為0、0.05g/L、0.10g/L、0.15g/L、0.20g/L、0.25 g/L，將pH調節為7.0，經121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，冷卻置于超凈臺內，將處于對數期的藻液轉接至搖瓶內，接種量為10%，充分搖勻后置于恒溫光照搖床內進行無菌培養，轉速150 r/min，溫度25℃，光照強度為（50±10）μmol/（m2·s）。

1.3.4響應面試驗優化小球藻純培養條件［12］

在單因素試驗基礎上，以乙酸（A）、丙酸（B）、丁酸（C）和乙醇（D）為影響因素，小球藻的細胞數（Y）為響應值，利用Design-Expert 7.0軟件設計試驗方案，各因素與水平的設計如表1所示［8-9］。

表1　Box-Behnken試驗設計的因素與水平Table 1 Factors and levels for Box-Behnken experiments design g/L

2　結果與分析

2.1不同乙酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長情況

圖1　乙酸含量對小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.1 Effect of acetic acid concentration onChlorellasp.biomass

由圖1可知，添加不同量的乙酸對小球藻Chlorellasp.生長均有促進作用，當乙酸質量濃度為1.0 g/L時，小球藻培養至第7天時的生物量為最大，能達到9.4×107CFU/mL。乙酸是小球藻生長中的碳源，小球藻可以利用乙酸進行混養生長。研究表明，產酸廢水提供的碳源主要是厭氧產酸反應器產生的乙酸以及其他小分子有機酸，小球藻在生長過程中能很好的利用水解液中的小分子有機酸［13-14］。結果表明，培養基中乙酸含量為0.8～1.2 g/L為宜。

2.2不同丙酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長情況

圖2　丙酸含量對小球藻Chlorella sp.生物量的影響Fig.2 Effect of propionic acid concentration onChlorella sp.biomass

由圖2可知，丙酸可以作為小球藻生長的碳源，添加丙酸有利于小球藻的生長。當丙酸質量濃度為0.4 g/L時，小球藻培養至第7天時的細胞數為最大，能達到7.5×107CFU/mL。研究表明，產酸廢水提供的碳源主要是厭氧產酸反應器產生的丙酸等其他小分子的有機酸和乙醇，小球藻在生長過程中能很好的利用水解液中的小分子有機酸［13-14］。結果表明，培養基中丙酸含量為0.3～0.5 g/L為宜。

2.3不同丁酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長情況

圖3　丁酸含量對小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.3 Effect of butyric acid concentration onChlorella sp.biomass

由圖3可知，丁酸可以作為小球藻生長的碳源，添加丁酸有利于小球藻的生長。當丁酸質量濃度為0.4g/L時，小球藻培養至第7天時的細胞數為最大，能達到7.5×107CFU/mL。研究表明，產酸廢水提供的碳源主要是厭氧產酸反應器產生的丁酸等其他小分子的有機酸和乙醇，球藻在生長過程中能很好的利用水解液中的丁酸［13-14］。結果表明，培養基中丁酸含量為0.3～0.5 g/L為宜。

2.4不同戊酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長情況

圖4　戊酸含量對小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.4 Effect of valeric acid concentration onChlorellasp.biomass

由圖4可知，戊酸也可以作為小球藻生長的碳源，添加戊酸有利于小球藻的生長。當戊酸質量濃度為0.25 g/L時，小球藻培養至第7天時的細胞數為最大，能達到5.7× 107CFU/mL。研究表明，產酸廢水提供的碳源主要是厭氧產酸反應器產生的戊酸等其他小分子的有機酸和乙醇，小球藻在生長過程中能利用水解液中的戊酸［13-14］。結果表明，培養基中戊酸含量為0.15～0.25 g/L為宜。

2.5不同乙醇含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長情況

圖5　乙醇含量對小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration onChlorellasp.biomass

由圖5可知，乙醇可以作為小球藻生長的碳源，添加適量的乙醇有利于小球藻的生長。當乙醇質量濃度為0.15 g/L時，小球藻培養至第7天時的細胞數為最大，能達到6.3× 107CFU/mL。研究表明，產酸廢水提供的碳源主要是厭氧產酸反應器產生的乙醇和小分子的有機酸，小球藻在生長過程中能很好的利用水解液中的乙醇［13-14］。結果表明，培養基中乙醇含量為0.10～0.20 g/L為宜。

2.6不同異丁酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長情況

圖6　異丁酸含量對小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.6 Effect of isobutyric acid concentration onChlorellasp.biomass

由圖6可知，異丁酸也可以作為小球藻生長的碳源，添加適量的異丁酸也有利于小球藻的生長。當異丁酸的質量濃度為0.15g/L時，小球藻培養至第7天時的細胞數為最大，能達到5.1×107個/mL。研究表明產酸廢水提供的碳源主要是厭氧產酸反應器產生的異丁酸和其他小分子有機酸和乙醇，小球藻在生長過程中能很好的利用水解液中的異丁酸［13-14］。結果表明，培養基中異丁酸含量為0.3～0.5 g/L為宜。

2.7不同異戊酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長情況

由圖7可以看出，異戊酸可以作為小球藻生長的碳源，添加適量的異戊酸有利于小球藻的生長。當異戊酸的濃度為0.2 g/L時，小球藻培養至第7天時的細胞數為最大，能達到4.6×107個/mL。研究表明，產酸廢水提供的碳源主要是厭氧產酸反應器產生的異戊酸和其他小分子有機酸和乙醇，小球藻在生長過程中能利用水解液中的異戊酸［13-14］。結果表明，培養基中異戊酸含量為0.15～0.25 g/L為宜。

圖7　異戊酸含量對小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.7 Effect of isovaleric acid concentration onChlorellasp.biomass

2.8混合酸小球藻Chlorellasp.的生長優化

表2　響應面試驗的設計及其結果Table 2 Design and results of response surface experiments

由單因素試驗結果可以看出，小球藻Chlorellasp.在添加乙酸、丙酸、丁酸和乙醇的培養基中，生物量較高，對小球藻的生長起到明顯的促進作用，藻體的長勢比較好，在單因素試驗的基礎上，以乙酸（A）、丙酸（B）、丁酸（C）和乙醇（D）質量濃度為自變量，小球藻的生物量（Y）為響應值，對其進行響應面優化設計，確定適合小球藻生長的最佳有機酸組合［15］。響應面試驗設計及結果見表2。

使用Design-Expert 7.0軟件數據進行分析得到了各因素與小球藻細胞數的回歸方程：

使用Design-Expert 7.0軟件對表2中29組試驗進行分析回歸擬合后得到擬合全變量二次回歸方程的方差分析及顯著性檢驗結果見表3。

表3　二次回歸模型的方差分析結果Table 3 variance analysis of response surface quadratic model

由表3可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），回歸模型的決定系數R2=0.990 5，說明此模型與數據的擬合度較高。從回歸模型的顯著性可以看出，一次項中A、B、C對結果影響極顯著（P＜0.01），二次項中A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項中AB、AC、BD對結果影響極顯著（P＜0.01）。失擬項P=0.090 6＞0.05，說明模型擬合度很好，能夠用回歸方程模擬小分子有機酸對小球藻生物量的影響。

2.9確定最佳有機酸濃度組合

根據Design-Expert 7.0軟件，繪制出小球藻生物量隨自變量變化的響應面和等高線，結果見圖8。

圖8　丁酸、丙酸、乙酸和乙醇交互作用對小球藻生物量影響的響應面及等高線Fig.8 Response surfaces plots and contour line of effect of interaction between butyric acid，propionic acid，acetic acid and ethanol onChlorellasp.biomass

由圖8可知，乙酸、丙酸、丁酸和乙醇兩因素之間的交互作用較強，對藻的生長能起到明顯的促進作用。根據等高線圖和響應面立體分析圖可以得到最佳優化條件：乙酸1.02 g/L、丙酸0.42 g/L、丁酸0.4 g/L、乙醇0.18 g/L，預測響應值為10.8×107CFU/mL。在此最優條件下進行驗證試驗，實際測得小球藻生物量為為11.8×107個/mL，與預測值基本一致。

3　結論

以小球藻細胞數為評價指標做單因素試驗，可以得出乙酸、丙酸、丁酸和乙醇對小球藻生長的促進作用較為明顯，在適宜的有機酸/醇濃度下，小球藻的單位體積細胞數在培養至7 d時分別能達到9.4×107個/mL、7.5×107個/mL、7.5×107個/mL、6.3×107個/mL。為進一步提高小球藻的生物量，以乙酸、丙酸、丁酸和乙醇四個關鍵因素為自變量，以小球藻的細胞數為響應值進行藻體培養條件的優化，得到了小球藻的Chlorellasp.最優發酵條件：乙酸1.02 g/L、丙酸0.42 g/L、丁酸0.4 g/L、乙醇0.18 g/L，預測響應值為10.8×107CFU/mL。按照此最優培養條件進行優化，測得小球藻的Chlorellasp.的細胞數11.8×107CFU/mL，較優化前的細胞數明顯提高，為獲得較高濃度的微藻生物質提供科學參考。

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Study on the cultivation of Chlorella sp. using small molecular organic acid/alcohol

HUANG Daming1，KONG Miao1，HUO Shuhao1*，QIAN Jingya1，XU Ling1，DU Zhuorong1，ZHOU Weizheng2，CUI Fengjie1，ZOU Bin1
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Guangzhou Institute of Energy Conversion，Key Laboratory of Renewable Energy，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640，China）

Chlorellasp.pure culture experiments was carried out by using the strain with tolerance properties on hydrolysis-acidification liquid and high lipid yield and adding different concentration of small molecule organic acid/alcohol（acetic acid，propionic acid，butyric acid，isobutyric acid，valeric acid，isovaleric acid and ethanol）into BG11 medium.On the basis of single factor experiments，the effect of mixed small molecule organic acids/alcohol（acetic acid，propionic acid，butyric acid and ethanol）on growth ofChlorellasp.was investigated by response surface experiments.The research indicated that when the concentration of acetic acid，propionic acid，butyric acid and ethanol were 1.02 g/L，0.42 g/L，0.40 g/L and 0.18 g/L，respectively，Chlorellasp.had a highest cell number，optimum growth situation and higher biomass（1.18×108CFU/ml）.

small molecular organic acid/alcohol；Chlorellasp.；biomass

S968，Q949.2

0254-5071（2016）02-0029-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.007

2015-11-18

國家自然科學基金項目（21506084）；江蘇省自然科學基金項目（BK20140540）；中國博士后科學基金（2014M551519；2015T80502）；中國科學院可再生能源重點實驗室開放基金（y507k11001）

黃達明（1962-），教授，博士，主要從事農產品生物轉化與綜合利用研究工作。

霍書豪（1983-），講師，博士，主要從事廢棄物生物轉化與生物加工技術研究工作。