蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料發(fā)酵條件的優(yōu)化

黃永光，姜　瑩，周紀(jì)廷，趙辰路，周文美*（.貴州大學(xué) 白酒研究院，貴州 貴陽(yáng) 55005；.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 55005）

蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料發(fā)酵條件的優(yōu)化

黃永光1，姜瑩2，周紀(jì)廷2，趙辰路2，周文美2*
（1.貴州大學(xué) 白酒研究院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

以蕎麥和馬尾松花粉為原料，研制蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料。對(duì)5株酵母菌進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以酒精度和總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出優(yōu)良酵母；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，選擇安琪甜酒干酵母為發(fā)酵菌種，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為料液比1∶6（g∶mL）、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間7 d。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下制得的蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度為6.2%vol，總黃酮含量為92.92 μg/mL。

蕎麥；馬尾松花粉；發(fā)酵工藝；格瓦斯飲料

蕎麥和馬尾松花粉都為我國(guó)西南地區(qū)的特色資源。研究表明，蕎麥營(yíng)養(yǎng)豐富，其中蛋白質(zhì)和維生素B1、B2含量較高，干粉中含有約65 mg/kg的蘆丁，而蘆丁能夠影響胰島細(xì)胞的功能，促進(jìn)胰島素的分泌，從而降低血糖；同時(shí)，可以調(diào)節(jié)血壓、強(qiáng)化血管，對(duì)腦溢血、網(wǎng)膜出血等有一定的預(yù)防、治療作用［1］；所含的可溶性膳食纖維約占膳食纖維總量的20%～30%，具有降低血清總膽固醇及低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量的作用［2］。馬尾松花粉藥食兼用的歷史在中國(guó)已逾數(shù)千年［3-4］，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)界譽(yù)為“完全營(yíng)養(yǎng)源”［5］，被廣泛應(yīng)用于藥品、保健品等領(lǐng)域，其具有抗氧化［6］、調(diào)節(jié)血脂［7］等功能。馬尾松中所含的植物甾醇具有降低機(jī)體膽固醇含量的功效，在功能性食品中應(yīng)用廣泛，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

格瓦斯飲料口感與外觀特性介于啤酒與碳酸飲料之間，既保存了啤酒豐富的泡沫與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又不會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生酒精作用，同時(shí)，既具備了碳酸飲料清爽的口感，又不會(huì)損壞身體健康，是一款極佳的酒類、碳酸飲料的替代飲料。傳統(tǒng)的格瓦斯飲料采用俄式面包發(fā)酵而成，工藝較為復(fù)雜，且飲料成本較高；現(xiàn)代食品技術(shù)采用類似于啤酒發(fā)酵的方法生產(chǎn)格瓦斯飲料，但降低了格瓦斯飲料的口感與風(fēng)味。市面上的格瓦斯口味較為單一，除了原味格瓦斯外，只有蜂蜜格瓦斯以及小米、黑米、玉米格瓦斯幾種較為單一的口味。格瓦斯飲料的宣傳中側(cè)重于格瓦斯飲料的健康性與保健性，但由于格瓦斯飲料目前發(fā)展單一，既不利于提高格瓦斯的健康性，也對(duì)于格瓦斯飲料擴(kuò)大受眾群體較為不利。因此，未來(lái)格瓦斯飲料的發(fā)展應(yīng)面向產(chǎn)品口味多元化，提高飲料健康性。采用更為豐富的原料進(jìn)行格瓦斯生產(chǎn)，同時(shí)，在保證傳統(tǒng)格瓦斯焙烤香、麥芽香的風(fēng)味下，簡(jiǎn)化格瓦斯飲料生產(chǎn)工序。

本研究以甜蕎麥、苦蕎麥、大麥為原料，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。并與松花粉這種對(duì)人體更加有益的原材料相搭配，開(kāi)發(fā)一款除保留傳統(tǒng)格瓦斯焙烤香與麥芽香外，同時(shí)融合了天然馬尾松花粉清香的格瓦斯飲料。并且蕎麥中的黃酮和馬尾松花粉中的可溶性多糖豐富了格瓦斯飲料的營(yíng)養(yǎng)成分，在格瓦斯飲料中添加了新的健康理念。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

苦蕎麥：貴州師范大學(xué)生物育種研究室提供；中溫7658淀粉酶（2 000 U/g）：北京東華強(qiáng)盛生物有限公司；糖化酶（50 000 U/g）：湖南省津市新型發(fā)酵有限責(zé)任公司；甜蕎麥、大麥、食醋、丹寶利活性干酵母、安琪活性干酵母、發(fā)利活性干酵母、安琪葡萄酒果酒專用酵母、安琪釀甜酒干酵母均為市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：貴州迪達(dá)生物有限責(zé)任公司。

1.2儀器與設(shè)備

LK-1000A中藥粉碎機(jī)：四川江陽(yáng)粉碎設(shè)備有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；722s可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；80-2離心機(jī)：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；LDZX-40AI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；手持糖度計(jì)、手持酒精計(jì)：北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料制作工藝流程及操作要點(diǎn)［8-12］

蕎麥→去雜→洗凈→浸泡→種子萌發(fā)→烘干→粉碎→原料調(diào)配→液化→糖化→接種酵母→發(fā)酵→酒液分離→風(fēng)味調(diào)配→澄清→灌裝→滅菌→成品

操作要點(diǎn)：

種子萌發(fā)：用清水將甜蕎麥和苦蕎麥洗凈，清水浸泡24 h，瀝干后平鋪于盤(pán)中，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

粉碎：發(fā)芽后的種子置于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，然后粉碎，過(guò)40目篩。

原料比例調(diào)配：甜蕎麥芽、苦蕎麥芽、大麥芽按照1∶2∶1的比例進(jìn)行混合。

馬尾松花粉破壁：將馬尾松花粉按料液比1∶20（g∶mL）加水，在60℃、300 W超聲條件下，進(jìn)行25 min破壁處理。

液化方法：在調(diào)配好的麥芽中加入一定量的無(wú)菌水，然后加入0.5%的淀粉酶，85～90℃水浴30 min。

糖化方法：將液化好的麥芽降溫至60℃，調(diào)節(jié)pH值為3.5，添加4%的糖化酶、60℃水浴中保溫40 min。

酵母活化：取一定量的活性干酵母，加入25倍活性干酵母量的5%葡萄糖溶液中，45℃水浴中活化40 min。

發(fā)酵：在糖化后的麥芽中添加0.5%酵母菌，按照一定量料液比在適宜的溫度下進(jìn)行發(fā)酵。

酒液分離：將發(fā)酵后的酒液放入離心管中，3 000 r/min離心30 min。

風(fēng)味調(diào)配：在發(fā)酵液中加入一定量的蔗糖、檸檬酸和破壁后的馬尾松花粉進(jìn)行風(fēng)味調(diào)配。

澄清：加入0.6 g/L高效飲料澄清劑，靜置2 h。

灌裝：將澄清部分的酒液進(jìn)行灌裝。

巴氏殺菌：在65～70℃條件下保溫12～15 min。

冷卻：將滅菌后的產(chǎn)品放置室溫條件下進(jìn)行降溫。

1.3.2菌種的選擇

選用安琪活性干酵母、安琪甜酒干酵母、發(fā)利活性干酵母、安琪葡萄酒果酒專用酵母、丹寶利活性干酵母5種菌種按照上述方法進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵條件為甜蕎麥芽、苦蕎麥芽、大麥芽按照1∶2∶1的比例進(jìn)行混合，在料液比1∶5（g∶mL）、菌種添加量為0.5%（以原料干質(zhì)量計(jì)，下同）、發(fā)酵時(shí)間為7 d、溫度28℃條件下發(fā)酵。分別測(cè)定5種菌種發(fā)酵所得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度、總黃酮含量，篩選發(fā)酵性能良好的菌株。

1.3.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取20 g調(diào)配好的麥芽（甜蕎麥芽∶苦蕎麥芽∶大麥芽= 1∶2∶1），按照1.3.1的方法對(duì)麥芽進(jìn)行液化、糖化后，添加0.5%安琪甜酒干酵母，考察料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL））、發(fā)酵溫度（24℃、26℃、28℃、30℃、32℃）、發(fā)酵時(shí)間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對(duì)蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響。

1.3.4正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用酵母發(fā)酵菌種，以蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度、總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)料液比（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）進(jìn)行優(yōu)化，最終確定蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5分析測(cè)定方法

總黃酮化合物含量的測(cè)定：采用分光光度計(jì)法［13］。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.030 0 g，置于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液定容至刻度，得到0.3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL至50 mL容量瓶中，加入l.4 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置5 min后，加入1.4 mL 10%硝酸鋁溶液，振蕩搖勻靜置20 min后，加入10 mL l mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻后，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液稀釋至刻度，靜置20 min后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值［14］，以蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

酒精度的測(cè)定：采用酒精度計(jì)法［15］。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵菌種選擇

選用安琪活性干酵母、安琪甜酒干酵母、發(fā)利活性干酵母、安琪葡萄酒果酒專用酵母、丹寶利活性干酵母5種菌種進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定5種菌種發(fā)酵所得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　5菌種發(fā)酵液中酒精度和總黃酮含量的影響Table 2 Effect of five kinds of strains on alcohol content and total flavonoids content in the fermented liquid

由表2可知，在相同試驗(yàn)條件下，安琪甜酒曲的活性最高，酒精度為5.1%vol，總黃酮含量為81.986 μg/mL。因此，選用安琪甜酒干酵母為發(fā)酵菌種。

2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以空白作為參比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.009 7x+0.001 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。由此可見(jiàn)，蘆丁的質(zhì)量濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1料液比對(duì)酒精度、總黃酮含量的影響

考察不同料液比對(duì)蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　料液比對(duì)蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料酒精度（A）和總黃酮含量（B）的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on alcohol content（A）and total flavonoids content（B）in buckwheat-masson pine pollen beverage

由圖2（A）可知，隨著料液比的增加，發(fā)酵液中酒精度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，料水比較低時(shí)，發(fā)酵液黏稠度過(guò)高，導(dǎo)致發(fā)酵液發(fā)酵不充分，因此發(fā)酵液酒精度較低。當(dāng)料液比為1∶6（g∶mL）時(shí)，發(fā)酵液中酒精度最大，為5.3%vol。當(dāng)料液比較高時(shí)，由于發(fā)酵液稀釋，導(dǎo)致酒精度含量降低。由圖2（B）可知，隨著料液比的增加，發(fā)酵液中總黃酮含量先增加后減少，當(dāng)料液比為1∶6時(shí)，發(fā)酵液中總黃酮含量達(dá)到最大值，為87.936 μg/mL；當(dāng)料液比＞1∶6（g∶mL）時(shí)，由于發(fā)酵液稀釋，含水量高，發(fā)酵液中總黃酮含量降低。因此，綜合考慮，選擇料液比為1∶5～1∶7（g∶mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2發(fā)酵溫度對(duì)酒精度、總黃酮含量的影響

考察不同發(fā)酵溫度對(duì)蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3（A）可知，當(dāng)溫度＜28℃時(shí)，酒精度較低，這是由于溫度低時(shí)，酵母菌活性較低，導(dǎo)致發(fā)酵不完全；當(dāng)發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，發(fā)酵液的酒精度最高，為4.8%vol；當(dāng)溫度＞28℃時(shí)，酵母菌活性受到抑制，使酒精度降低。由圖3（B）可看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，總黃酮含量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，發(fā)酵液中總黃酮含量最高，為86.446 μg/mL；再繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，總黃酮含量開(kāi)始下降。因此，綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度為28～32℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3　發(fā)酵溫度對(duì)蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料酒精度（A）和總黃酮含量（B）的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content（A）and total flavonoids content（B）in buckwheat-masson pine pollen beverage

2.3.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度、總黃酮含量的影響

圖4　發(fā)酵時(shí)間對(duì)蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料酒精度（A）和總黃酮含量（B）的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content（A）and total flavonoids content（B）in buckwheat-masson pine pollen beverage

考察不同發(fā)酵溫度對(duì)蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4（A）可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的酒精度逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵至第6天時(shí)，發(fā)酵液中酒精濃度趨于平緩，發(fā)酵至第8天時(shí)，酒精度達(dá)到最大值，為4.2%vol；繼續(xù)發(fā)酵，酒精度略有降低，這是由于發(fā)酵液中酒精轉(zhuǎn)化為酸，使得發(fā)酵液酸度增加；由圖4（B）可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中總黃酮含量迅速增加后趨于平緩，當(dāng)發(fā)酵至第7天時(shí)總黃酮含量達(dá)到最高，為86.759 μg/mL，繼續(xù)發(fā)酵，總黃酮含量變化不大，因此，綜合考慮，選擇發(fā)酵時(shí)間為6～8 d進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)料液比、溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表3　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表4　以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using alcohol content as evaluation index

表5　以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using flavonoids content as evaluation index

由表3結(jié)果可知，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)酒精度結(jié)果影響的因素順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞料水比＞發(fā)酵溫度，最佳工藝參數(shù)組合為A2B1C2；以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)總黃酮含量影響的順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞料水比，根據(jù)極差R的大小可知，最佳工藝參數(shù)組合為A2B1C2。由表4、表5方差分析可知，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，發(fā)酵時(shí)間與料液比達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），發(fā)酵溫度達(dá)到顯著水平（P＜0.05），以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料水比均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），與極差分析相符合，因此，選擇最佳工藝參數(shù)組合為A2B1C2，即料水比1∶6（g∶mL），發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d。在此最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，酒精度為6.2%vol，總黃酮含量為92.916 μg/mL。由此可見(jiàn)，優(yōu)化蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的工藝是切實(shí)可行有效的。

3　結(jié)論

本研究以蕎麥和馬尾松花粉為原料，選用安琪甜酒活性干酵母為發(fā)酵菌種，制作蕎麥-馬尾松花粉飲料。在單因素的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)該飲料的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為料液比1∶6（g∶mL）、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間7 d，在此最佳工藝條件下，所得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料中酒精度為6.2%vol，總黃酮含量為92.916 μg/mL。飲料顏色呈金黃略偏黃綠色，具有濃郁的麥芽香氣，甜度較高。

［1］張曉寧，郭慶賀，楊旭，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化苦蕎飲料加工工藝［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（24）：270-273，278.

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Optimization of fermentation conditions of KbaC beverage with buckwheat-masson pme pollen

HUANG Yonghuang1，JIANG Ying2，ZHOU Jiting2，ZHAO Chenlu2，ZHOU Wenmei2*
（1.Institute of Liquor，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.GuizhouProvince Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using buckwheat as raw material，the KbaC beverage was developed.The superior yeasts were screened from fine yeasts with alcohol content and total flavonoid content as evaluation index.On the basis of single factor experiments，three main factors including solid to liquid ratio，fermentation temperature and time were optimized by orthogonal experiments.Results showed that angel liqueur dry yeast was selected as the fermentation strain.The optimum fermentation technical parameters were as follows∶solid to liquid ratio 1∶6（g∶ml），fermentation temperature 28℃，fermentation time 7 d.Under the optimum fermentation conditions，the alcohol content and total flavonoid content of buckwheat-masson pine pollen KbaC beverage obtained were 6.2%vol and 92.92 μg/ml，respectively.

buckwheat；masson pine pollen；fermentation technology；KbaC beverage

TS261.9

0254-5071（2016）02-0061-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.014

2015-11-04

貴州省科技廳重大專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字［2012］601-5號(hào)）；貴州省科技計(jì)劃（黔科合農(nóng)G字［2015］4003號(hào)）

黃永光（1976-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榘拙莆⑸锛熬祁愂称钒踩?/p>

周文美（1964-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)及食品生物技術(shù)。