響應面法優化復合乳酸菌培養條件

王　建，羅紅霞，于佳弘，汪長鋼，張　俊（北京農業職業學院 食品與生物工程系，北京 102442）

響應面法優化復合乳酸菌培養條件

王建，羅紅霞*，于佳弘，汪長鋼，張俊
（北京農業職業學院 食品與生物工程系，北京 102442）

將從青貯飼料中自行分離得到的3株優良乳酸菌組成復合乳酸菌，利用響應面分析法對復合乳酸菌的培養條件進行優化，在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken Design設計試驗，并利用Design Expert 8.0.6軟件對模型和各因素的顯著性及可信性進行分析，優化后的最佳培養條件為：培養溫度37℃、初始pH值為7.0、接種量（配比為1∶1∶1）4%。在此最佳條件下，獲得的乳酸菌菌落數對數值為9.79。

培養條件；響應面法；復合乳酸菌

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指能使碳水化合物（主要為葡萄糖）發酵產生大量乳酸的細菌的通稱［1］。乳酸菌是人類和動物的腸道中占舉足輕重地位的優勢菌群之一，能夠有效地調節機體狀態，對生物體維持健康方面能發揮比較重要的作用。具有優良性狀的乳酸菌可以在食品業中作為發酵劑使用，也可在飼料制備中作為酸化劑使用，還可以制作成調節腸道的各種益生制劑，為動物和人類的健康貢獻力量。研究表明，在青貯飼料中添加乳酸菌有增加乳酸濃度、抑制霉菌繁殖和提高青貯飼料品質的作用［2］。

將兩種或多種乳酸菌菌株進行混合復配共同發酵，其發酵能力、益生效果都要強于單株乳酸菌。復合菌株的培養在發酵食品生產、環境和能源有效利用等相關領域已有相應的一些經驗累積和應用［3］。目前，國內外研究較多的復合乳酸菌主要集中在由雙歧桿菌和乳桿菌組成的益生菌及其制品［4-5］，應用在藥品、保健品、食品等方面，發揮乳酸菌的益生功效［6-7］。

響應面分析（response surface methods，RSM）方法基于數學與統計學的結合，它是將體系的響應作為一個或多個因素的函數，運用圖形技術將這種函數關系顯示出來，以選擇試驗設計中的最優化條件［8］。響應面分析方法可以快速有效地確定多因子系統的最佳條件，目前已廣泛應用于各類培養基及發酵條件的優化實踐中［9-15］。

本試驗從青貯飼料中篩選出3株產酸性能強、生長速度快，且抑菌效果較好的優良乳酸菌菌株組成復合乳酸菌，利用響應面分析法（RSM）對其培養條件進行優化。根據優化后的培養條件，提高復合乳酸菌的存活率，從而獲得較高菌體數量，為后期復合乳酸的菌體富集、菌粉加工提供研究基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）NZ3、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）NZ7及干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）NZ9均分離自玉米青貯飼料；脫脂乳粉：市售。

1.1.2培養基

MRS培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，七水硫酸錳0.05 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.8。

1.1.3主要化學試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖：北京陸橋技術有限責任公司；吐溫-80、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸錳（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；150A生化培養箱：江蘇省金壇市醫療儀器廠；BL310電子天平：德國塞多利斯公司；828型pH測試儀：美國Orion公司；T6紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌體生長測定

（1）乳酸菌數的測定［16］

將菌株NZ3、NZ7和NZ9以1∶1∶1的比例、按2%（V/V）接種量接種至MRS液體培養基中，制成復合乳酸菌液。

取100 μL復合乳酸菌液加入900 μL滅菌生理鹽水中，依次做10倍稀釋，選取3個適宜的連續稀釋倍數進行平板計數，每個稀釋度做3個平行。

（2）菌體生長曲線

將復合乳酸菌液培養（24±2）h，每2 h取一次樣，在波長600 nm條件下測定光密度值OD600nm，以培養時間t為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制復合乳酸菌的生長曲線。

1.3.2單因素試驗選取因素水平

（1）培養溫度對菌株生長的影響

選擇培養溫度33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，調節初始pH值為6.0，將復合乳酸菌液（復配比例1∶1∶1）接種2%，分別在不同的培養溫度條件下培養16 h，測定乳酸菌數。

（2）初始pH對菌株生長的影響

將MRS液體培養基的初始pH分別調為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，分別接種2%復合乳酸菌液，37℃培養16 h，測定乳酸菌數。

（3）接種量對菌株生長的影響

設定復合乳酸菌（復配比例1∶1∶1）接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，將復合乳酸菌分別接種于MRS液體培養基中，調節初始pH值為7.0，37℃培養16 h，測定乳酸菌數。

1.3.3響應面法優化培養條件

以乳酸菌數作為響應目標，利用響應面方法中的Box-Behnken Design（BBD）方法設計試驗，通過試驗數據擬合得到二階響應面模型，最終確定最優試驗條件。用Design Expert8.0.6軟件對試驗數據進行分析。

2　結果與分析

2.1復合乳酸菌菌體生長曲線

以培養時間為橫坐標，OD600nm值及pH值為縱坐標，繪制復合乳酸菌的生長曲線，結果如圖1所示。

圖1　復合乳酸菌生長曲線Fig.1 The growth curve of compound lactic acid bacteria

由圖1可知，復合乳酸菌在接種后0～4h開始緩慢生長，進入菌體生長的遲緩期，此時，隨著菌體的生長，菌液的pH開始出現下降，說明菌體發酵開始產酸；在6～10 h內生長迅速，處于對數生長時期，同時pH下降較快，說明在此時期菌體產酸較多。當培養10～18 h，菌體生長速率保持平穩，進入穩定期，此時pH也趨于平穩。培養時間＞18 h以后，菌體數量出現下降，說明菌體生長進入到了衰亡期，而pH值依然處于平穩狀態，說明乳酸菌在生長過程中不斷產生乳酸，而當乳酸濃度累積到一定水平時，菌體生長就會受到制約。因此，該復合乳酸菌的最佳培養時間應控制在10～18 h。

2.2單因素試驗［17-18］

2.2.1培養溫度對復合乳酸菌生長的影響

將復合乳酸菌接種于MRS培養基中，不同溫度條件下培養16 h，乳酸菌活菌數對數值變化結果見圖2。

圖2　培養溫度對復合乳酸菌生長的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖2可知，隨著培養溫度的升高，乳酸菌數先升高后下降，差異顯著。在37℃培養時，活菌數對數值達到最大值9.18 lg（CFU·mL-1）。當培養溫度＜37℃時，溫度過低，酶活性受抑制，酶促反應遲緩，導致菌體生長和代謝緩慢。但當溫度過高時，酶的活性又重新受到抑制，故當培養溫度＞37℃后，乳酸菌數出現降低。因此，確定該復合乳酸菌的適宜培養溫度為37℃。

2.2.2初始pH對復合乳酸菌生長的影響

將復合乳酸菌接種于不同初始pH值的MRS培養基中，37℃溫度條件下培養16 h，乳酸菌活菌數對數值變化結果見圖3。

圖3　初始pH對復合乳酸菌生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖3可知，活菌數隨著初始pH的升高，呈現先增大后減少的總體趨勢，在初始pH值為為7.0時，活菌數對數值達到最大值9.15 lg（CFU·mL-1）。初始pH值＞7.0以后，活菌數有下降趨勢。因此，確定培養基初始pH值為7.0。

2.2.3接種量對復合乳酸菌生長的影響

將復合乳酸菌（復配比例1∶1∶1）按不同接種量接入到MRS培養基中，初始pH值為7.0，37℃培養16 h后測定乳酸菌活菌數，結果見圖4。

圖4　接種量對復合乳酸菌生長的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖4可知，不同接種量培養后，活菌數存在較大的差異，當接種量為3%和4%時，菌體數量明顯高于其他3組，從經濟方面考慮，選定3%為最適宜接種量。

2.3響應面法優化培養條件［19-21］

在單因素試驗的基礎上，通過Design Expert 8.0.6的Box-Behnken設計原理，對復合乳酸菌培養條件進行了3因素3水平試驗，所得試驗結果如表1所示。

表1　響應面試驗設計及結果Table 1 Design and results of response surface experiments

以乳酸菌數對數值（Y）為響應值，根據Box-Behnken Design（BBD）設計的試驗結果，利用Design Expert 8.0.6軟件對表1數據進行分析，得到乳酸菌數與培養溫度（A）、初始pH（B）及接種量（C）的二次多項回歸方程：Y=9.55-0.41A+ 0.54B+0.20C-0.095AB+0.012AC-0.090BC-1.48A2-0.28B2-0.19C2。對回歸模型進行可信度分析和方差分析，結果如表2所示。

表2　回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

由表2可知，模型F=467.12，P＜0.000 1，說明該回歸方程是極顯著的。失擬項不顯著，說明該模型模擬性較好。模型的復相關系數R2=0.9983，修正復相關系數R2Adj=0.996 2，預測復相關系數R2Pred=0.9851，表明修正復相關系數0.9962與預測復相關系數0.985 1有很好的相符度，說明該模型具有較好的回歸性。模型信噪比＞4是令人滿意的，該模型的信噪比為62.485，顯示該模型具有足夠的信號來響應該設計。因此，該模型能夠對乳酸菌數進行分析和預測。

模型數據顯示，一次項A、B、C及二次項A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、BC影響顯著（P＜0.05），各因素的影響主次順序：B＞A＞C，即培養初始pH值＞培養溫度＞接種量。利用Design Expert 8.0.6軟件獲得了各因素的最佳培養條件為：培養溫度36.34℃、初始pH值為6.93、接種量3.58%，在此條件下獲得的乳酸菌數對數值預測值為9.87。為了驗證響應面模型的有效性，考慮到實際操作的方便性，將各因素修正為培養溫度37℃、初始pH值為7.0、接種量4%，在此修正條件下進行3次平行試驗，得出乳酸菌數對數值實際值為9.79。

培養溫度、初始pH值、接種量兩兩交互作用對乳酸菌數的影響的響應曲面及等高線，結果如圖5所示。

圖5　培養溫度、初始pH值和接種量交互作用對乳酸菌數影響的響應曲面圖及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between culture time，initial pH and inoculum on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖5可知，培養溫度和初始pH的交互作用較顯著，初始pH值和接種量的交互作用較弱。在一定培養時間下，乳酸菌數隨著培養溫度的上升而呈現上升趨勢，在37℃時達到最高值，之后隨著溫度繼續升高而呈現下降趨勢。在固定培養溫度時，隨著初始pH的增加，乳酸菌數出現先增加后降低的趨勢。

3　結論

利用響應面法（RSM）中的Box-Behnken Design（BBD）設計試驗，并使用Design Expert 8.0.6軟件進行數據分析，對復合乳酸菌培養條件進行優化，獲得良好的效果，優化后的二次多元回歸模型為：Y=9.55-0.41A+0.54B+0.20C-0.095AB+0.012AC-0.090BC-1.48A2-0.28B2-0.19C2，獲得了各因素的最佳培養條件為：培養溫度37℃、初始pH值為7.0、接種量4%。在此條件下，獲得的乳酸菌數對數值為9.79。為該復合乳酸菌的后續研究提供理論基礎和菌種條件。

［1］楊潔彬.乳酸菌-生物學基礎及應用［M］.北京：中國輕工業出版社，1996.

［2］周德寶.青貯飼料的研究、發展及現狀［J］.氨基酸和生物資源，2004，26（2）：32-34.

［3］徐穎宣，徐爾尼，馮乃憲，等.微生物混菌發酵應用研究進展［J］.中國釀造，2008，27（9）：1-4.

［4］杜鵬，霍貴成.國內外益生菌制品發展現狀［J］.食品科學，2004，25（5）：194-198.

［5］雷蕓.益生菌及其制品研究和應用開發的最新進展［J］.甘肅聯合大學學報：自然科學版，2013，27（1）：114-116.

［6］朱韶娟.復合乳酸菌粉的開發及其保健功能評價［D］.廣州：華南理工大學碩士論文，2014.

［7］哈爾阿力，劉艷豐，唐淑珍，等.不同復合乳酸菌組合菌株對全株玉米青貯品質的影響［J］.飼料廣角，2012，20（9）：44-47.

［8］章銀良.食品與生物試驗設計與數據分析［M］.北京：中國輕工業出版社，2010.

［9］洪梅，刁其玉，閆貴龍，等.響應面法優化青貯飼料乳酸菌的培養條件［J］.動物營養學報，2010，22（5）：1307-1313.

［10］徐子鈞，李劍，梁鳳來，等.利用SAS軟件優化L-乳酸發酵培養基［J］.微生物學通報，2004，31（3）：85-88.

［11］黃麗金，陸兆新，袁勇軍，等.響應面法優化唾液鏈球菌嗜熱亞種增殖培養基［J］.食品與發酵工業，2005，31（5）：27-32.

［12］張建友，徐靜波，王軍良，等.凍干乳酸菌菌種增菌培養基增殖因子的優化［J］.微生物學通報，2006，33（1）：16-17.

［13］熊智強，徐平，涂國全.利用響應面法優化紅谷霉素發酵培養基［J］.微生物學通報，2006，33（4）：5-9.

［14］楊實權，張喜成，劉軍鋒，等.響應面法優化釀酒酵母產油脂條件［J］.微生物學通報，2010，37（1）：91-95.

［15］PANKAJ S，MANPREET S，ASHWINNI L K.Response surface optimization of the critical medium components for carbonyl reeducates production byCandida viswanathiiMTCC 5158［J］.Bioresource Technol，2007，98（4）∶829-833.

［16］凌代文.乳酸菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業出版社，1999.

［17］田菊梅，梁琪，張炎等.低溫乳酸菌混菌培養條件的優化［J］.食品工業科技，2013，34（1）：180-183.

［18］王蔚淼.青貯飼料中乳酸菌的鑒定及生物學特性的研究［D］.合肥：安徽農業大學碩士論文，2006.

［19］羅紅霞，任發政，郭慧媛，等.響應面法優化二氧化碳殺滅蛋殼大腸桿菌工藝研究［J］.食品工業科技，2011，32（11）：283-285.

［20］韓爽，韓玲，王軍，等.曲拉復合乳酸菌增殖培養基的優化［J］.食品工業科技，2015，36（19）：243-248.

［21］常偉，饒瑜，胡懷容，等.一種抗真菌食竇魏斯氏菌AT6的特性分析及培養條件的優化［J］.食品工業科技，2014，35（6）：193-196.

Optimization of culture conditions for compound lactic acid bacteria by response surface methodology

WANG Jian，LUO Hongxia*，YU Jiahong，WANG Changgang，ZHANG Jun
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China）

The three superior lactic acid bacteria strains separate from silage were constituted as compound lactic acid bacteria.The culture conditions of compound lactic acid bacteria were optimized by response surface methodology.On the basis of single factor experiments，the significance and creditability of model and the factors were analyzed by Box-Behnken design and software Design Expert 8.0.6.The optimum culture conditions were culture temperature 37℃，initial pH 7.0 and inoculum（ratio of three strains was 1∶1∶1）4%.Under the optimum conditions，the colony count of lactic acid bacteria was 9.79.

culture conditions∶response surface methods；compound lactic acid bacteria

TS252.54

0254-5071（2016）02-0066-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.015

2015-10-02

北京市教委2015年度科技計劃以及社科計劃資助項目（KM201512448007）

王建（1975-），女，副教授，碩士，研究方向為食品微生物、食品質量監控。

羅紅霞（1962-），女，教授，博士，研究方向為食品微生物、食品質量監控。