水牛乳中高產胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定

唐　艷，謝　芳，楊承劍，農皓如，馮　玲，曾慶坤（中國農業科學院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

水牛乳中高產胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定

唐艷，謝芳*，楊承劍，農皓如，馮玲，曾慶坤
（中國農業科學院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

從生水牛乳中篩選出兩株高產胞外多糖（EPS）的乳酸菌株LB2、LB7，經MRS肉湯培養基發酵后，菌液中的胞外多糖（EPS）產量分別達135 mg/L、148 mg/L，通過形態學、生理生化特征、API細菌鑒定系統、16S rRNA序列分析，鑒定出菌株LB2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），LB7為類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）。將其應用到水牛乳酸奶的發酵中，結果表明，植物乳桿菌LB2和類腸膜魏斯氏菌LB7均可用來發酵水牛乳酸奶，且能有效增加酸奶的黏度和胞外多糖產量，其黏度和EPS產量分別為4 050 mPa·s和149 mg/L。

乳酸菌；胞外多糖；篩選；菌種鑒定

乳酸菌胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中形成的位于細胞壁外的黏液多糖或莢膜多糖，屬于微生物胞外多糖的一種［1］。酸奶是以鮮奶或乳制品為原料，經均質（或不均質）、殺菌、冷卻后加入特定微生物發酵劑、保溫發酵而制成的產品。酸乳在生產過程中乳酸菌會產生一種多糖類物質，即乳酸菌胞外多糖［2］。乳酸菌胞外多糖可賦予酸乳特殊的質構和風味，如增加酸乳的黏性和流變性、提高酸乳的持水性防止乳清析出、增強凝乳強度、增加酸乳的口感等［3］。因乳酸菌是食品級微生物生產菌，相較其他菌安全性高，所以近年來乳酸菌胞外多糖的研究逐漸增多，各國科學家試圖用基因工程的手段構建高產胞外多糖菌株，但至今仍未成功。目前用于發酵酸乳的菌株產胞外多糖量很低，遠不能滿足生產所需［4］。因此高產胞外多糖乳酸菌的篩選、工藝的優化等仍是當下研究的熱點。水牛乳作為我國南方地區特有的乳制品，其營養價值頗高，本試驗從生鮮水牛乳中篩選出10株乳酸菌，對其進一步分離純化，從中篩選出2株高產胞外多糖的乳酸菌，并對其進行了種屬分類鑒定，旨為將此類高產胞外多糖乳酸菌應用到水牛乳酸奶發酵中，并研制出富含EPS的水牛乳酸奶，為今后水牛乳高附加值功能性產品的開發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮水牛奶：取自水牛研究所種牛場；API50CH、API50 CHL試劑：法國梅里埃公司。

乳酸菌分離培養基：含20 g/L CaCO3的MRS固體培養基；菌種活化培養基為體積分數10%的脫脂水牛乳；MRS培養基：北京陸橋公司；MRS肉湯培養基：廣東凱環生物科技公司。

葡萄糖、蔗糖：蘇州正洋化工科技有限公司；30%過氧化氫：天津市科密歐化學試劑有限公司；G1060革蘭氏染色試劑盒：北京索寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

SPX-150生化培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；YM50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器材有限公司；5804R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；JD500-2型電子天平：梅特勒-托多利儀器有限公司；LNG-T88臺式快速冷凍離心機：上海趙迪生物科技有限公司；722可見光分光光度計：上海光學儀器廠；尼康ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡：Nikon日本公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器：北京國華科技集團有限公司；NDJ-1型旋轉黏度計：上海精科實業有限公司；TMS-Pro質構儀（食品物性分析儀）：美國FTC公司；HI8424便攜式pH檢測儀：意大利HANNA（哈納）公司；乳脂分離機：北京夏音嘉塑科技有限公司；BCD-246WTM冰箱：美的集團。

1.3方法

1.3.1乳酸菌的分離純化

無菌條件下，將新鮮水牛乳進行梯度稀釋后涂布于含20 g/L CaCO3的MRS平板上，于37℃培養24 h。挑取肉眼可見、生長較快、單個有溶鈣圈、呈黏液狀的菌落，分離并純化，根據菌落特征進行初步歸類，將革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株作為進一步篩選的乳酸菌待選菌株，經反復劃線分離培養，直至獲得純菌落為止，將其編號后于4℃保存備用。

1.3.2產胞外多糖乳酸菌的篩選

將上述備用乳酸菌分別接種于滅菌后的全脂水牛乳中，37℃增菌培養活化，再以5%體積量分別轉接入20 mL滅菌水牛乳中，每菌株2個平行樣，37℃培養24 h。

1.3.3產胞外多糖乳酸菌的鑒定

菌株的形態及生理生化鑒定：將分離保存的菌種劃線于MRS固體培養基上，觀察菌落形態及大小、顏色、邊緣及隆起狀況，在生化顯微鏡下觀察革蘭氏染色后的菌體形態特征。并考察菌株的生長溫度（4℃、10℃、15℃、45℃）、耐酸堿性（37℃條件下pH 4.5及pH 9.6）以及耐鹽性（37℃條件下NaCl 6.5%及18%，在此條件下能生長），同時進行接觸酶實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗及碳水化合物發酵實驗等生理生化實驗［5］。

菌株的API試劑鑒定：采用API細菌鑒定系統對未知產EPS的株乳酸菌進行鑒定。取適量經過活化后的菌液于API 50 CHL液體培養基中，搖勻，接入API 50 CH試劑條中，用滅菌后的液體石蠟封口，30℃培養24 h或48 h觀察試劑條顏色的變化，最后通過API LAB Plus V5.0軟件鑒定菌種。

1.3.4含EPS水牛乳酸奶的制作及其pH和黏度的測定

全脂水牛乳于95℃條件下滅菌12 min，冷卻至37℃，無菌條件下，按8%接種量分別接種活化好的產EPS乳酸菌菌種，于42℃發酵至凝固，置4℃冰箱后熟24 h備用。分別記錄其凝乳時間，觀察其色澤及組織狀態，并測定酸奶的pH和黏度［6-7］。

1.3.5測定方法

黏度的測定：NDJ-1型旋轉黏度計，采用3號轉子，30轉/min，黏度計算公式為：η=K·α，其中，η為黏度，K為系數，α為指針所指讀數（偏轉量）。

樣品EPS產量的測定：采用苯酚-硫酸法［8］測定發酵乳中EPS的含量。取10 mL純菌株發酵乳樣品，加入5 mL體積分數為80%的三氯乙酸，12 000 r/min離心40 min，除去菌體和蛋白，將離心后的上清液裝入透析袋中流水透析48 h。透析液中加入3倍體積的體積分數為95%的乙醇，在4℃冷藏過夜，多糖呈現絮狀沉淀析出，4℃、10 000 r/min離心20 min，除上清液，得到沉淀后的胞外多糖［9］。將胞外多糖溶于10mL蒸餾水中，得到EPS的水溶液。取2 mL樣品液于25 mL比色管中，加入6%的苯酚2 mL，再加入10 mL濃硫酸，在波長625 nm處測定吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線［10］。

2　結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線的繪制

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標準曲線回歸方程為y=0.887 8x-0.022 8，相關系數R2=0.998 7，表明葡萄糖質量濃度與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2乳酸菌的分離及其菌落特征、細胞形態

本試驗共分離了10株乳酸菌，因乳酸菌在生長過程中產酸較多，故在添加了CaCO3的MRS平板上，菌落周圍有較清晰的溶鈣圈，一般乳球菌表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，凸起，灰白色或白色；乳桿菌表面呈雪花狀，半透明，扁平，白色或灰白色，有黏性，菌落形態見圖2。經革蘭氏染色，鏡檢觀察，10株初篩乳酸菌中有2株球菌，編號LB1～2，8株桿菌，編號為LB3～10，乳桿菌的細胞形態為長桿狀或短桿狀，大多呈短鏈或長鏈排列；乳球菌多為圓形，以單生或短鏈狀排列，無鞭毛，不運動；其細胞形態桿菌與球菌各取一株典型菌株進行鏡檢，結果如圖3所示。

圖2　乳酸菌LB2在MRS平板上的菌落形態Fig.2 Colony morphology of lactic acid bacteria LB2 in MRS tablet

圖3　初篩乳酸菌的細胞形態Fig.3 Cell morphology of preliminary screened lactic acid bacteria

2.3高產EPS乳酸菌菌株的篩選

將分離所得的10株未知乳酸菌活化后，接種到MRS肉湯培養基中，37℃培養24 h，測定其EPS產量，以取高產胞外多糖的乳酸菌作為下一步優選菌株鑒定作參考。結果如表1所示。

表1　分離乳酸菌菌液的EPS產量Table 1 EPS production of separated lactic acid bacteria liquid

由表1可知，在同等底物和培養條件下，10株乳酸菌均能產EPS，且不同乳酸菌菌液EPS產量不同，其中LB2和LB7產量最高，分別為135 mg/L和148 mg/L。因此，選擇菌株LB2及LB7作進一步鑒定。

2.4高產EPS乳酸菌菌種的鑒定

參照文獻［11-12］，對分離出的10株乳酸菌中產EPS最高的LB2和LB7兩株菌進行生理生化實驗，借助API鑒定系統，結果見表2。

表2　兩株高產EPS乳酸菌的生理生化鑒定結果Table 2 Physiology and biochemistry identification results of two strains of high yield EPS

從表2菌株的生化實驗結果可看出，LB2、LB7的各項檢測特征分別符合《常見細菌系統鑒定手冊》中關于植物乳酸桿菌和魏斯氏菌的描述，后又通過16S rRNA序列測定［13］，其鑒定結果：菌株LB2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），LB7為類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesen teroides）。

2.5高產EPS乳酸菌的發酵性能

將已鑒定的、產EPS最高的兩株LB2和LB7作為目標菌種來發酵水牛乳，并隨機選擇之前分離出的產EPS較低的菌株LB1及LB8作為對照，測定其水牛乳酸奶的pH值、凝乳時間、黏度及EPS產量，結果如表3所示。

表3　產EPS乳酸菌發酵水牛乳特性Table 3 Characteristics of buffalo milk fermentation by EPS producing lactic acid bacteria

由表3可知，產EPS的這4株乳酸菌均在11～12 h內達到發酵終點，各菌株發酵水牛乳酸奶的pH值均在3.80左右，說明其產乳酸能力相差不大。但是這4種發酵乳的黏度及EPS產量差異較大，LB7發酵的水牛乳酸奶黏度及EPS產量最大，分別為4 050 mPa·s、149 mg/L；LB2次之，分別為3 970 mPa·s、142 mg/L；LB8最小，說明酸奶在發酵過程中，菌體通過不斷分泌胞外多糖來使水牛乳酸奶的黏稠度增加，這與表3中發酵水牛乳的黏度與EPS產量呈正相關一致。乳酸菌所產生的胞外多糖對酸奶的質地黏度、口感及乳清析出都具有重要意義，同時也是評定酸奶感官品質的一個重要指標［14］，亦可作為天然增稠劑和穩定劑來使用，具有較好的經濟效益。

3　結論

試驗通過涂布平板、斜面劃線從生水牛乳中分離純化出10株乳酸菌，用MRS肉湯活化培養后，均能發酵產胞外多糖（EPS），其中LB2和LB7菌株產量最高，分別達135mg/L、148 mg/L。

通過生理生化實驗、API細菌鑒定系統、16Sr RNA序列分析鑒定兩株高產EPS菌株：LB2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），LB7為類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）。

將菌株LB2和LB7分別用來發酵水牛乳酸奶，通過檢測其黏度、pH、EPS產量，進一步證實了LB2和LB7具有高產EPS和優良的發酵性能。

乳酸菌胞外多糖能賦予發酵乳制品特殊的質構和風味，因能起到安全食品添加劑的作用，而廣泛用于食品的增稠、穩定、乳化、膠凝及持水等方面［15］。本研究將從水牛乳中分離出來的產EPS乳酸菌應用到酸奶的發酵中，以制備出高產EPS的水牛乳酸奶，為今后水牛乳高附加值功能性產品的開發提供理論依據。

［1］李清春，張景強，賀稚非.乳酸菌胞外多糖的研究［J］.電子科技大學報，2003，32（6）：764-765.

［2］劉芳，黃丹，陳永貴，等.一株高產胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定［J］.中國乳品工業，2013，41（12）：17-18.

［3］勵建榮，封平.乳酸菌產胞外多糖的研究［J］.食品與機械，2005（1）：70-73.

［4］羅玲泉.酸乳胞外多糖提取及高產胞外多糖酸乳發酵劑研究［D］.長沙：湖南農業大學碩士論文，2007.

［5］凌代文，東秀珠.乳酸菌細菌分類鑒定及試驗方法［M］.北京：中國輕工業出版社，1995.

［6］楚炎沛.物性測試儀在食品品質評價中的應用研究［J］.糧食與飼料工業，2003（7）：40-42.

［7］孫彩玲，田紀春，張永祥.TPA質構分析模式在食品研究中的應用［J］.實驗科學與技術，2007（4）：1-4.

［8］張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.杭州：浙江大學出版社，1999.

［9］劉先，康小紅，孫軍德.高產胞外多糖乳酸菌的篩選與初步鑒定［J］.農產品加工·學刊，2010（3）：39-40.

［10］DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Anal Chem，1956，28（3）∶350-356.

［11］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001.

［12］BUCHNAN R，GIBBONS E.伯杰氏鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，1984.

［13］商婷婷，張日俊.乳酸乳球菌和魏斯氏菌的分離及鑒定［J］.飼料工業，2013（16）：31-34.

［14］潘道東，吳玲.高產胞外多糖（EPS）乳酸菌菌株的篩選與鑒定［J］.食品科學，2007，28（3）：171-174.

［15］羅玲泉，劉成國，黃永鋒.乳酸菌胞外多糖及其對酸乳品質的影響［J］.食品工業科技，2007，28（6）：232-233.

Screening and identification of lactiv avid bacteria with hiht yield extravellular polysaccharides

TANG Yan，XIE Fang*，YANG Chengjian，NONG Haoru，FENG Ling，ZENG Qingkun
（Guangxi Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China）

Two lactic acid bacteria strains LB2 and LB7 with high yield extracellular polysaccharides（EPS）were screened from raw buffalo milk.After fermentation in MRS medium，the EPS production in fermentation broth was up to 135 mg/L and 148 mg/L，respectively.Through strains morphological，physiological and biochemical characteristics identification，API bacteria identification system，16S rRNA sequence analysis，the strain LB2 was identified asLactobacillus plantarum，LB7 was identified asWeissella paramesenteroides.The strains were applied to the buffalo milk fermentation，the results showed that LB2 and LB7 were available to ferment milk yogurt，and can effectively increase the viscosity of yogurt and extracellular polysaccharide production.The viscosity and EPS yield of the yogurt was 4 050 mPa·s and 149 mg/L，respectively.

lactic acid bacteria；extracellular polysaccharides；screening；strain identification

Q939

0254-5071（2016）02-0070-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.016

2015-12-04

廣西水牛研究所基本科研業務費項目（水?；?504011）

唐艷（1978-），女，助理研究員，本科，研究方向為乳品加工。

謝芳（1980-），女，實習研究員，本科，研究方向為乳品科學與食品微生物技術。