雙波長分光光度法測定油菜蜂花粉中總黃酮含量的研究

陳　云，封京京（馬鞍山市產品質量監督檢驗所，安徽 馬鞍山 243000）

雙波長分光光度法測定油菜蜂花粉中總黃酮含量的研究

陳云，封京京
（馬鞍山市產品質量監督檢驗所，安徽 馬鞍山 243000）

選用雙波長分光光度法測定油菜蜂花粉中總黃酮含量，并得到滿意結果。同時，研究了甲醇的水溶液作提取劑超聲提取蜂花粉黃酮類化合物，分別對甲醇體積分數、料液比及超聲提取時間等條件進行了優化。在甲醇體積分數為60%、料液比1∶40（g∶mL）、提取時間1.5 h條件下，總黃酮提取率為2.64%。方法重現性試驗相對標準偏差（RSD）為0.53%；加標回收率平均值為97.13%，RSD為0.25%。該方法重現性好、準確度高，適合油菜蜂花粉中總黃酮含量測定。

油菜蜂花粉；總黃酮；超聲波；雙波長分光光度法

油菜為我國大面積種植的農業經濟作物，十字花科，蕓苔屬植物［1］。蜂花粉是蜂蜜采集的雄蕊花藥的粉狀物質，是植物生命之源。其包含花蜜和蜂蜜的唾液，富含黃酮類物質等多種營養成分［2］。黃酮類化合物具有眾多的生理功能和藥用價值，其主要作用有抗衰老、增強心血管功能、治療慢性前列腺、調節內分泌系統、抗炎、護肝、抗過敏、抗病毒、抑菌、抗潰瘍、降血糖、抗輻射和抗腫瘤等［3-8］。目前國內外對油菜蜂花粉中總黃酮乙醇提取的研究報道較多，多采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［9-10］、比色法［11-13］，對于甲醇超聲提取的研究報道較少。本研究根據NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色反應，為避免底液出現渾濁現象而采用雙波長分光光度法對油菜蜂花粉中總黃酮測定工藝條件進行研究。試驗固定絡合反應時間，對甲醇體積分數、料液比、超聲時間3因素分別進行單因素試驗及正交試驗，以雙波長條件下吸光度差值計算總黃酮提取率，確定最佳提取工藝，為油菜花粉資源的綜合利用提供了科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

油菜蜂花粉：青海金門源油菜花蜜采集基地。蘆丁對照品（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究所；甲醇（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、石油醚（沸程30～60 ℃）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

TU-1901紫外可見分光光度計：北京譜析通用儀器公司；AL204型萬分之一電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；CQ-300B-S型超聲波機：上海躍進醫用光學器械廠；HC-2000Y2粉碎機：永康市天棋盛世工貿有限公司；Soxtec 2055索氏抽提儀：美國Foss公司。

1.3實驗方法

1.3.1原料預處理

稱取一定量的油菜蜂花粉，放入索氏抽提儀，加入石油醚抽提8 h，除去油脂和色素雜質，抽提后自然干燥備用。稱取1.000 0 g試樣于150 mL錐形瓶中，料液比1∶20（g∶mL），加入體積分數為60%甲醇溶液，超聲波（超聲功率300 W、頻率28 kHz）振蕩1 h，過濾，用體積分數為60%甲醇溶液定容至50 mL。

1.3.2蘆丁標準溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用體積分數為60%甲醇定容至刻度，制成貯備液。取貯備液10 mL于50 mL容量瓶中，用體積分數為60%甲醇定容，得到質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。

1.3.3總黃酮檢測分析方法

總黃酮含量采用分光光度法［14］進行分析。分別吸取一定量蘆丁標液于25 mL容量瓶中，加水至6.0 mL，加入質量分數5%NaNO2溶液和10%Al（NO3）3溶液各1 mL，搖勻，放置6 min，加入質量分數4.3%NaOH溶液10 mL，加水至刻度。絡合反應15min，試劑空白為參比溶液，測定吸光度值。

比色法用于組成單一的蘆丁對照物時，結果準確，但是油菜蜂花粉的組成復雜，測定時易受到花色素、鞣酸及其他酚類成分的多種物質干擾，在堿性條件下，許多多元酚會與Al3+發生同樣的顯色反應，而且底液常常出現渾濁現象，測定結果明顯偏高，且重復性不好。因此，本方法選擇510 nm作為油菜蜂花粉總黃酮含量的測定波長，584 nm為參比波長［15］。

根據顯色反應方法，在波長510 nm和584 nm條件下測定吸光度值，得到吸光度差值△A=A510nm-A584nm。用蘆丁標準曲線回歸方程計算得出樣品液總黃酮質量濃度，總黃酮提取率（以蘆丁計，%）計算公式如下：

式中：C為從標準曲線查得的總黃酮質量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；K為提取液稀釋倍數；m為蜂花粉樣品質量，g。

1.3.4總黃酮提取工藝優化單因素試驗

樣品液取1 mL于25 mL容量瓶，選取甲醇體積分數（40%、60%、80%、100%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL））、超聲時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）為考察因素，研究某一單一因素變化對總黃酮提取率的影響，其他條件固定在甲醇體積分數為60%，料液比1∶20（g∶mL），超聲時間1 h（功率300 W、頻率28 kHz、室溫），絡合反應時間15 min。

1.3.5總黃酮提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對總黃酮的提取工藝條件進行3因素3水平的正交試驗，以雙波長條件下吸光度差值為考察指標，確定最佳提取工藝，正交試驗因素與水平見表1。

表1　提取工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for extraction technology optimization

1.3.6方法重現性和加標回收率試驗

方法重現性試驗：在最佳工藝條件下，樣品液取1 mL按照1.3.3方法測定吸光度差值，由蘆丁標準曲線計算出樣品中總黃酮提取率，平行試驗5次，并計算出對標準偏差（relative standard deviation，RSD）；加標回收率試驗：分別稱取5份1.000 0 g油菜蜂花粉試樣，各加入8.0 mg蘆丁對照品，計算回收率及RSD。

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制

分別吸取質量濃度為0.2mg/mL的蘆丁標準溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，按照1.3.3顯色方法，測得波長510nm、584nm條件下的吸光度值，得到吸光度差值△A= A510nm-A584nm，以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度差值△A（y）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，結果見圖1。

圖1　 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1可知，蘆丁標準曲線的線性方程為：y=7.442 9x-0.002 2，相關系數R2=0.999 4，表明蘆丁質量濃度在0.008～0.040 mg/mL范圍內，二者有良好的線性關系。

2.2甲醇體積分數對總黃酮提取的影響

圖2　甲醇體積分數對提取效果的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction efficiency

由圖2可知，體積分數為60%的甲醇超聲提取液在加入顯色體系時不產生渾濁現象，提取效果最好。究其原因可能是體積分數為60%的甲醇的極性比體積分數80%和100%的強，能夠溶解一些極性相對較大的黃酮類物質并且在顯色體系加入時不產生渾濁，而體積分數40%的甲醇溶解黃酮類物質較少，提取效果較差。因此選擇甲醇體積分數為60%。

2.3料液比對總黃酮提取的影響

圖3　料液比對提取效果的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency

由圖3可知，當料液比由1∶20（g∶mL）增加到1∶40（g∶mL）的過程中，總黃酮提取效果增強，在料液比＞1∶40（g∶mL）之后，隨著料液比的增加提取效果變化平緩，這表明當料液比為1∶40（g∶mL）時，總黃酮已被提取完全。考慮到降低成本，節約溶劑，因此選擇料液比為1∶40（g∶mL）。

2.4超聲時間對總黃酮提取的影響

圖4　超聲時間對提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction efficiency

由圖4可知，超聲時間＜1.5 h時，隨著時間的延長，總黃酮的提取效果增強，而超聲時間＞1.5 h之后，提取效果反而下降。其可能是超聲時間的延長使得黃酮類化合物發生降解或者是超聲時間太長使提取物中雜質含量增加，黃酮類化合物提取效果反而降低。因此，選擇超聲時間為1.5 h。

2.5正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，對總黃酮的提取工藝條件進行3因素3水平的正交試驗，以雙波長條件下吸光度差值△A為考察指標，確定最佳提取工藝，正交試驗結果與分析見表2，正交試驗結果方差分析見表3。

表2　提取工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction technology optimization

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

從表2可知，各因素對油菜蜂花粉的影響大小分別為B＞A＞C，即料液比＞甲醇體積分數＞超聲時間。超聲法提取油菜蜂花粉中總黃酮的最佳提取條件為A1B2C2，即體積分數為60%的甲醇溶液，料液比1∶40（g∶mL），超聲時間1.5 h。在此最佳條件下，油菜蜂花粉中總黃酮的提取率為2.643%。

由表3可知，甲醇體積分數、料液比及提取時間對結果影響均顯著（P＜0.05）。

2.6重現性及加標回收率試驗

按照1.3.6方法進行重現性和加標回收率試驗，結果分別見表4及表5。

由表4和表5可知，最佳工藝條件下，油菜蜂花粉的總黃酮提取率為2.643%重現性試驗，檢測結果的相對標準偏差（RSD）為0.532%，加標回收率平均值為97.13%，RSD為0.25%。結果表明，該檢測方法重現性好，準確度高。

表5　加標回收率試驗結果Table 5 Results of recovery rate tests

3　結論

綜上所述，本實驗確定了油菜蜂花粉中總黃酮的最佳提取工藝為體積分數為60%的甲醇溶液，1∶40（g∶mL）的料液比，超聲提取時間1.5 h，絡合反應15 min。在此條件下，油菜蜂花粉中總黃酮提取率2.643%。重現性試驗重現性試驗相對標準偏差為0.532%，加標回收率平均值為97.13%，RSD為0.25%。該方法重現性好，準確度高，適合測定油菜蜂花粉中總黃酮含量。

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Determination of total flavonoids in rape bee-pollen by double-wavelength spevtrophotometry

CHEN Yun，FENG Jingjing
（Maanshan Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Maanshan 243000，China）

The content of total flavonoids in rape bee-pollen was determined by double-wavelength spectrophotometry，and the determination results were satisfactory.Using the methanol aqueous solution as extracting agent，flavonoids compounds in bee-pollen was researched by ultrasonic wave extraction.The methanol concentration，solid-liquid ratio and ultrasonic extraction time were optimized.Under the conditions of methanol concentration 60%，material-liquid ratio 1∶40（g∶ml）and extraction time 1.5 h，the extraction ratio of total flavonoids was 2.64%.Relative standard deviation（RSD）of reproducibility tests was 0.53%.The average recovery rate was 97.13%，and RSD was 0.25%.The method had good reproducibility and high accuracy，which was suitable for determination of total flavonoids in rape bee-pollen.

rape bee-pollen；total flavonoids；ultrasound wave；double-wavelength spectrophotometry

S896.4

0254-5071（2016）02-0131-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.030

2015-12-01

陳云（1988-），女，助理工程師，本科，研究方向為食品化工檢驗。