一種減肥膠囊中總黃酮測定前處理條件的研究

劉　靜，李月娟（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

一種減肥膠囊中總黃酮測定前處理條件的研究

劉靜，李月娟
（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

該試驗以蘆丁為對照品，采用分光光度法對一種減肥膠囊中總黃酮含量進行測定。通過對提取液濃度、超聲時間、超聲溫度、洗脫速度等前處理條件進行優化，確定了最佳的樣品前處理條件：用體積分數為60%的乙醇提取，70℃條件下超聲40 min，甲醇洗脫速度為1滴/2～3 s。該試驗操作簡單，穩定性、精密度及準確性良好。

減肥膠囊；總黃酮；檢測；前處理條件

黃酮類化合物也稱類黃酮，是廣泛存在于植物界的一大類多酚化合物，具有防癌抗癌、抗腫瘤、防心腦血管疾病以及抗氧化的作用［1］。黃酮類化合物在人體中不能直接合成，只能從食品中獲取，人們常從銀杏葉、葛根、蜂膠中提取黃酮［2］。隨著食品工業的發展和消費水平的不斷提高，黃酮類化合物在醫學、食品保健等領域得到廣泛應用，對于黃酮類化合物的研究也成為熱點。目前，黃酮類化合物的定性定量檢測方法主要有紫外分光光度法、薄層層析法、絡合分光光度法、高效液相色譜法等，其中高效液相色譜法主要用于微量組分的測定分析［3］，紫外分光光度法則利用黃酮分子結構中羥基和芳環形成較強的共軛體系，對紫外光有較強的特征吸收進行測定［4］。

黃酮類化合物的提取方法主要有水提法、醇提法、CO2超臨界流體提取法、酶解法、超聲波法等［5］?！侗＝∈称窓z驗與評價技術規范》中有關保健食品功效成分及衛生指標檢驗規范的檢驗方法之保健食品中總黃酮的測定作為現行的測定保健食品中總黃酮含量的通用方法，主要是利用乙醇處理，超聲提?。ǔ曁崛》梢员苊庖蚣訜岫瘘S酮類化合物結構成分發生變化）［6］。該標準中規定超聲時間為20 min，但在試驗中發現超聲時間和超聲溫度都對測定結果有較大影響；層析柱用久了容易被聚酰胺粉堵塞，洗脫速度變慢，同一條件下測定的吸光度值變化較大，但該技術規范中對洗脫速度沒有進行明確規定，此外，對于提取劑乙醇體積分數也沒有進行明確規定，通過查閱《中國藥典》［7］得知，在沒有標識乙醇體積分數時，默認其體積分數為95%。不同待測物由于組成成分不同，在得到最大提取量時乙醇體積分數也不盡相同。于修燭等［8］利用響應面優化得出乙醇體積分數64.5%、超聲溫度65℃、超聲時間60 min條件下處理枳椇子中總黃酮結果最優；崔瑋等［9］研究了超聲輔助提取對甘青虎耳草中總黃酮含量測定的影響，得出乙醇體積分數80%、超聲溫度50℃、超聲時間35 min條件下處理甘青虎耳草結果最優；呂鳳嬌等［10］研究了黃芪中總黃酮乙醇提取工藝；朱攀攀等［11］研究了超聲處理條件對血橙皮渣中黃酮類物質的影響；周蕾等［12］研究了不同提取溶劑對鑲鼎蔘膠囊中總黃酮含量的影響；徐玲花等［13］研究了女貞子總黃酮提取工藝；張吉祥等［14］利用正交試驗法優化超聲提取棗核中總黃酮；劉建祥等［15］研究了保健食品中總黃酮的提取及含量測定。

本試驗針對一種組成成分比較復雜的減肥膠囊，采用紫外分光光度法進行減肥膠囊中總黃酮含量的測定，分別研究了乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度、洗脫速度等前處理條件對測定結果的影響，找到了最佳的前處理條件，本試驗操作簡便，對復雜成分保健食品中總黃酮含量的測定有一定的參考價值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

減肥膠囊：市售；蘆丁標準品（純度99.5%）：北京百靈威科技有限公司；聚酰胺粉：上海中秦化學試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津利密歐化學試劑有限公司；甲醇（分析純）、苯（分析純）：天津市百世化工有限公司。

1.2儀器與設備

Evolution 60型紫外分光光度計：美國賽默飛世爾科技有限公司；AE163型分析天平：梅特勒-托利多集團有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；Elmasonic S150型超聲波提取儀：德國Elma（艾爾瑪）公司；層析柱（10 mm×300 mm）：廣州祿源化玻儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1標準曲線的繪制

黃酮類化合物具有特定的紫外吸收帶，其結構中由肉桂酰環產生的Ⅰ帶在波長300～400 nm處，由苯甲酰環產生的Ⅱ帶在波長240～285 nm處，不同的黃酮在這兩個吸收帶的吸收強度不同。含黃酮類化合物的試樣經一定的提取純化后，可直接于最大吸收波長處測定其吸光度值，不需要加入其它顯色劑進行顯色。本實驗以蘆丁為對照品，選擇其在Ⅰ帶的最大吸收波長360 nm作為測量波長，并以此為對照測定樣品總黃酮含量。

準確稱取蘆丁標準樣品5.0 mg，加少量甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，定容，配制成50 μg/mL蘆丁標準儲備液。

分別吸取蘆丁標準儲備液0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，以甲醇為空白參比，在波長360 nm條件下測其吸光度值，繪制蘆丁標準曲線。

1.3.2樣品測定

稱取一定量的試樣，置于25 mL容量瓶中，加入體積分數為95%的乙醇定容，搖勻后，超聲（功率150 W）提取20 min，靜置，吸取上清液1.0 mL于蒸發皿中，加1.0 g聚酰胺粉吸附，于水浴上揮干乙醇，轉入層析柱，先用20 mL苯液洗脫，棄去苯液，然后用甲醇洗脫，洗脫液定容至25 mL，以甲醇為空白參比，在波長360 nm處測定其吸光度值。樣品中總黃酮含量按以下公式進行計算：

式中：X為樣品中總黃酮含量，mg/100 g；A為試樣測定液中總黃酮含量，μg；M為試樣質量，g；V1為測定用試樣體積，mL；V2為試樣定容體積，mL。

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制

以吸光度值（y）為縱坐標，蘆丁質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1　 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1可知，標準曲線回歸方程y=0.003 1x-1.904 76×10-4，相關系數R2=0.999 85，表明二者線性關系良好。

2.2乙醇體積分數對總黃酮測定的影響

本試驗分別用體積分數為40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶解待測試樣，利用方法1.3.2處理樣品后進行總黃酮含量的測定，結果見圖2。

圖2　乙醇體積分數對總黃酮測定的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數的不斷增加，吸光度值也隨之增大，用體積分數60%乙醇處理樣品測得的吸光度值最大，隨后吸光度值出現下降，當乙醇體積分數＞80%時，樣品吸光度值變化趨于平緩。因此，乙醇體積分數60%為宜。

2.3超聲時間對總黃酮測定的影響

用體積分數60%乙醇溶解樣品，分別超聲（功率150 W）處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，然后進行總黃酮含量的測定，結果見圖3。

由圖3可知，隨著超聲時間的增加，吸光度值不斷增大，40 min時吸光度值達到最大，隨后吸光度值出現下降，表明增加超聲時間，有利于樣品中黃酮類物質的溶出，但超聲時間＞40 min后，如果繼續增加，可能會破壞樣品中黃酮類化合物，導致其分解，吸光度值隨之下降。因此，超聲時間40 min為宜。

圖3　超聲時間對總黃酮測定的影響

2.4超聲溫度對總黃酮測定的影響

用體積分數60%乙醇溶解樣品、超聲處理40 min，超聲溫度分別控制在室溫（20℃）、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，然后測定其吸光度值，結果見圖4。

圖4　超聲溫度對總黃酮測定的影響

由圖4可知，隨著超聲溫度的上升，在70℃時吸光度值達到最大，隨后出現下降，原因可能是在加熱過程中分子運動加速，使得樣品中總黃酮較好的溶解，吸光度值出現上升，當溫度＞70℃時，吸光度值出現下降，可能是由于溫度過高使樣品中部分黃酮類物質發生了分解。因此，超聲溫度70℃為宜。

2.5洗脫速度對總黃酮測定的影響

樣品經方法1.3.2處理后，在用甲醇洗脫時將洗脫速度分別設定為1滴/s、1滴/2 s、1滴/4 s、1滴/6 s，然后測定試樣中總黃酮含量，結果見圖5。

由圖5可知，當洗脫速度為1滴/s時，洗脫較快，測得的吸光度值也較??；洗脫速度為1滴/2 s時，洗脫速度變慢，測得的吸光度值有所增大；當洗脫速度達到1滴/4 s和1滴/6 s時，吸光度值逐漸上升，但影響不明顯。經過反復試驗發現，洗脫速度太快，洗脫不完全，測得的吸光度值偏?。幌疵撍俣忍?，吸光度值較大，但會影響試驗效率。因此，本試驗中保持洗脫速度為1滴/2～3 s，可以取得穩定的測定結果，并且人為容易控制。

圖5　洗脫速度對總黃酮測定的影響

2.6精密度試驗

取待測試樣，用優化好的前處理條件進行處理，然后測定其吸光度值，計算總黃酮含量，平行測定6次，計算其結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），分析該方法的精密度，結果見表1。

表1　精密度試驗結果Table 1 Results of precision tests

精密度的高低取決于隨機誤差的大小，RSD值越小，則精密度越高。由表1可知，本試驗檢測結果的RSD為1.3%，表明該方法的精密度良好。

2.7穩定性試驗

表2　穩定性試驗結果Table 2 Results of stability tests

取同一批號樣品，按照方法1.3.2制備溶液，分別在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min內測定吸光度值，計算相對標準偏差（RSD），結果見表2。

穩定性試驗是為了考察樣品隨著時間的變化含量變化的大小。由表2可知，本試驗結果的RSD為1.6%，表明處理后的樣品在30 min內基本穩定。

2.8加標回收率試驗

準確稱取2份相同的待測試樣，其中1份加入蘆丁對照品分別為0.4 μg和0.8 μg，兩份試樣同時按相同的分析步驟進行處理，同時測定兩份試樣中總黃酮含量，得到相應的加標回收率，結果見表3。

表3　樣品加標回收率試驗結果Table 3 Results of adding standard recovery rate

由表3可知，總黃酮的回收率為91.2%～106.2%，在90%～110%范圍內，表明該方法準確度高。

3　結論

本試驗對一種減肥膠囊中總黃酮含量進行測定，對測定的前處理條件進行優化，得到了最佳的樣品前處理條件，結果表明，加標回收率為91.2%～106.2%，精密度及穩定性試驗結果RSD分別為1.3%、1.6%，處理后的樣品在30 min內基本穩定，表明該方法具有較好的穩定性、準確性和精密度。與其他方法相比，本方法能直接測定總黃酮含量，不需要加入其他顯色劑進行顯色，從而避免了相關的干擾，而且實驗操作簡單、快速、準確。

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Pretreatment conditions of total flavonoids in a slimming capsule

LIU Jing，LI Yuejuan
（Gansu Institute of Food Inspection，Lanzhou 730030，China）

Using rutin as reference substances，total flavonoids content in a slimming capsule was determined by spectrophotometric method.The optimum sample pretreatment conditions were determined by optimizing extract concentration，ultrasonic time，temperature，elution speed.The results were as follows∶ethanol concentration 60%，ultrasound time 40 min at 70℃，elution speed 2-3 s per drop by using methanol as eluent.The operation was simple，and the stability，precision and accuracy of the methods were satisfactory.

slimming capsule；total flavonoids；determination；pretreatment condition

O657.3

0254-5071（2016）02-0135-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.031

2015-12-07

蘭州市科技計劃項目（2009-1-142）

劉靜（1984-），女，工程師，碩士，研究方向為食品科學。