核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽

夏　瑋,　沈艷紅,　付　迪,　張文清,　宛燕飛,　張　力

(1.華東理工大學上海市功能性材料化學重點實驗室,上海 200237; 2.成都利爾藥業有限公司,成都 610083)

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核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽

夏瑋1,沈艷紅1,付迪1,張文清1,宛燕飛2,張力2

(1.華東理工大學上海市功能性材料化學重點實驗室,上海 200237; 2.成都利爾藥業有限公司,成都 610083)

建立了核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽的方法,選擇異頭氫區(δ4.89～5.90)作為“指紋”鑒定區,以甘露聚糖肽標準品氫譜為參照圖譜,將鑒定的樣品譜圖與其比較,采用相關系數法計算樣品譜圖與標準譜圖的相似度,并對該方法的特異性、重復性及精密度進行驗證。經鑒定,9個不同批次的甘露聚糖肽樣品的鑒定結果均與標準圖譜一致,相似度均大于0.95,該方法具有很好的專屬性。核磁共振氫譜法用于甘露聚糖肽的定性鑒定,具有操作簡便、重復性好、專屬性強等優點。

核磁共振氫譜法; 甘露聚糖肽; 定性鑒定

甘露聚糖肽是中國首創的一種新型免疫促進劑,原名多抗甲素(Polyactin A,PAA),是從健康人咽喉部分離的α-溶血性鏈球菌33號菌株經深層培養、發酵提取而得到的一種糖肽類物質,具有抗血小板聚集、抗病毒、抗菌和抗呼吸系統感染等多種生物活性[1],臨床上被廣泛用于惡性腫瘤的輔助治療、白細胞減少癥和呼吸道反復感染等領域[2-4]。

核磁共振氫譜法是多糖組成和重復單元結構鑒定的有效方法,在分析過程中無需對多糖進行降解或者衍生,能分析不同多糖結構之間的細微差異,也能顯現少量內源性和外源性的污染物[5-6]。目前,核磁共振氫譜法被美國藥典[7]、歐洲藥典[8]、英國藥典[9]和中國藥典2010版[10]收錄,是歐洲藥典和WHO(World Health Organization)推薦的多糖質量控制方法[11]。文獻[12]曾報道采用核磁共振氫譜法,選擇異頭氫區域定性鑒別細菌多糖,特異性和重現性都優于之前使用的比色法,同時也適用于其他多糖試劑。

目前,甘露聚糖肽質量標準中采用化學顯色方法、紅外光譜法對其進行鑒別,但這些鑒別方法專屬性均不強,因此需建立一種專屬性強、操作簡便、重復性好的鑒別方法,以用于甘露聚糖肽的質量控制。本文擬采用核磁共振氫譜法對甘露聚糖肽進行定性鑒定,為其質量控制及質量標準的提高提供科學依據。

1　材料與儀器

甘露聚糖肽對照品(批號:140652-200401,中國藥品生物制品檢驗所),TSP (Trimethylsilyl-propionic)(氘代度98%,美國Sigma公司),重水(氘代度99.8%,北京希凱創新科技有限公司),甘露聚糖肽供試品(批號:140401,140501,140502,131101,131102,110901,G100102,091202,成都利爾藥業有限公司),板藍根糖肽(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司),云芝糖肽(南京森貝伽生物科技有限公司),臘梅花多糖(實驗室提取),葡甘露聚糖(純度>99%,西安瑞盈生物科技有限公司),半乳甘露聚糖(純度>99%,西安大豐收生物科技有限公司)。

DD2400-MR核磁共振儀(安捷倫科技有限公司),METTLER AE240型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)。

2　實驗方法

2.1溶液的配制

2.1.1TSP重水溶液的配制準確稱取10 mg 氘代TSP(3-三甲基硅基丙酸鈉),溶于5 mL D2O中,配成2 g/L的TSP重水溶液。

2.1.2樣品溶液的制備準確稱取甘露聚糖肽對照品及供試樣品各30 mg,加入0.5 mL 的D2O,超聲至完全溶解,加入10 μL 2 g/L的TSP重水溶液,超聲混合均勻,轉移至5 mm的核磁樣品管中。

2.2NMR測試條件

1H-NMR的共振頻率為400 MHz,采樣參數如下:脈沖序列(seqfil) s2pul,掃描次數(ct) 64,空掃次數(ss) 0,譜寬(sw) 8 012.8 Hz,脈沖角度(pw) 45,采樣時間(at) 2.556 s,接收增益(gain) 10,測試溫度(temp) 30 ℃,弛豫延遲時間(d1) 1.0 s,窗函數線寬因子(lb) 0 Hz。

2.3核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽

參照細菌多糖核磁鑒定方法[12],測定甘露聚糖肽供試品的1H-NMR譜,將特征鑒別區譜圖峰型和峰位移值與甘露聚糖肽對照品譜圖進行比對,譜圖相似度的測定采用相關系數法[13],采用Microsoft EXCEL軟件來分析所選定光譜區的數據,將供試品譜圖的Y軸坐標與對照品圖譜的Y軸坐標進行比較,計算相關系數r,如果r>0.95,認為兩者結構一致; 反之,則認為是未知樣品。

2.4方法學驗證

2.4.1特異性分別按2.1節中的樣品溶液制備方法及2.2節中的核磁條件測定葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖以及市售的其他種類多糖及糖肽類物質(板藍根糖肽、云芝糖肽、臘梅花多糖),與甘露聚糖肽標準譜圖的峰型和譜峰位移值比對,并計算相似度,評價該方法的特異性。

2.4.2重復性對同一批次的甘露聚糖肽供試品,按2.1節中的樣品溶液制備方法平行制備三份溶液,按2.2節中的核磁測定條件測試,與甘露聚糖肽標準譜圖的峰型和譜峰位移值比對,并計算相似度,評價該方法的重復性。

2.4.3精密度在不同日期的同一時間,在2.2節中的核磁測試條件下,對同一甘露聚糖肽供試品進行測試,與甘露聚糖肽標準譜圖的峰型和譜峰位移值比對,并計算相似度,評價該方法的精密度。

3　實驗結果

3.1鑒定區域的選擇

甘露聚糖肽主要由甘露糖組成,還含有少量葡萄糖及氨基酸(4%～6%)。糖鏈主鏈由1,6-甘露糖殘基構成,支鏈由1,2-,1,3-和末端連接的甘露糖殘基構成,在1,2,6-甘露糖殘基的O-2位形成分支點。圖1示出了30 ℃時甘露聚糖肽標準品的1H-NMR圖譜,譜圖信號主要集中在δ3.20～5.80之間,分為兩個區域:(1) 異頭氫區,δ5.80～4.40;(2) 環質子區,δ4.40～3.20。根據參考文獻[14],可將大部分信號進行歸屬,其中,δ:5.29,5.14,5.12,5.08,5.04,4.90分別為1,2-、1,3-、1,2,6-、1,2,6-1-和1,6-連接甘露糖殘基的異頭氫信號。

圖1　甘露聚糖肽標準品的1H-NMR譜圖(30 ℃)Fig.1　1H-NMR spectrum of mannatide standard(30 ℃)

從低場至高場,甘露聚糖肽1H-NMR譜中每個信號均可作為甘露聚糖肽鑒定的數據來源,但異頭氫區信號與其他信號相比,重疊干擾少,分辨率高,而且該區域譜峰化學位移、峰形與糖鏈重復單元中不同連接方式糖殘基的異頭質子一一對應。因此,選擇異頭氫區域作為甘露聚糖肽定性鑒定的指紋鑒定區域。在異頭氫區右側,HDO峰很高,會影響鑒定結果,因此鑒定區右端(高場)選擇不能小于4.89,多糖的異頭氫信號δ的選擇一般不會超過5.70,鑒定區左端(低場)界限設定為5.90。

3.2實驗條件的優化

3.2.1定標物的選擇理想的定標物要求化學惰性、易溶于溶劑、定標物譜圖信號對樣品信號不產生干擾。NMR實驗所用定標物一般有TMS(四甲基硅烷)、DSS (3-三甲基硅基丙磺酸鈉鹽)、TSP (3-三甲基硅基丙酸鈉)等[15]。TMS不溶于水,而甘露聚糖肽樣品由于極性較大,易溶于水,必須采用重水作為溶劑,因此可采用DSS或TSP作為定標物。但DSS結構中有3個亞甲基在1H-NMR譜中均有強信號出現,且為多重峰,可能與樣品中的信號相干擾。因此,本實驗選擇氘代TSP為定標物。

3.2.2測試溫度的選擇由于甘露聚糖肽中1,6-連接的甘露糖殘基含量很低,其異頭氫信號(圖2中D峰)很弱。又因其化學位移與水峰很接近,導致在常溫(25 ℃)下以肩峰形式出現在溶劑峰的左側。因此,考慮采用升高溫度的方式將溶劑峰移向高場,如圖2所示。隨著溫度的升高,溶劑峰移向高場,而1,6-連接的甘露糖殘基異頭氫信號化學位移改變很小,但溫度升高也對核磁探頭的壽命有一定影響。當溫度升至30 ℃,1,6-連接的糖殘基異頭氫信號已基本與水峰分離,因此,綜合考慮各因素的影響,將測定溫度設為30 ℃。

3.2.3樣品濃度的選擇核磁共振的信號強度與所測定物質的含量直接相關,質量濃度越高,信號相對越強; 反之,噪聲相對越強。樣品濃度的選擇要考慮樣品溶液的溶解性、流動性和譜圖的信噪比等,要求樣品在達到良好信噪比的情況下,也具備良好的溶解性及流動性。在30 ℃、采樣64次情況下,考察不同濃度的甘露聚糖肽對照品的δ5.29峰的信噪比(表1)和樣品溶液的均勻性(目測)。當質量濃度達到60 g/L時,譜圖信噪比良好,繼續增大濃度會導致樣品的溶解性和流動性較差,增加前處理及勻場的困難,故選擇60 g/L的質量濃度作為樣品測試濃度。

圖2　核磁測試溫度的考察Fig.2　1H-NMR spectra of mannatide at different temperatures

3.2.4掃描次數的選擇為保證良好的信噪比,在30 ℃、采樣64次情況下,對掃描次數進行優化,考察掃描8、16、32、64、128次,δ5.29處譜峰信噪比的變化,結果見表2。綜合考慮儀器的時間效率、信噪比等因素,將樣品測定的掃描次數定為64次。

表1　樣品濃度的考察結果

表2　掃描次數對信噪比的影響

3.2.5弛豫延遲時間的選擇在30 ℃、采樣64次情況下,考察不同弛豫延遲時間(1、2、5、10 s)對δ5.29處峰信噪比的影響,結果見表3。可見,弛豫延遲時間對δ5.29處譜峰信噪比影響不大,考慮儀器測試的時間效率,將弛豫延遲時間設定為1 s。

表3　弛豫延遲時間對信噪比的影響

3.3甘露聚糖肽的定性鑒定

在上述優化條件下,測定9個不同批次的甘露聚糖肽樣品(2009～2014年生產)的1H-NMR譜(圖3),參照細菌多糖核磁鑒定方法,選擇圖譜上 (δ4.9～6.0)區為特征鑒別區,與甘露聚糖肽對照品核磁譜圖峰型和峰位移值進行比對,并采用相關系數法計算譜圖與標準譜圖的相似度,具體計算方法如下:將對照品及供試品的1H-NMR譜數據轉化為ASCII形式的XY數據文件(其中X為化學位移,Y為信號強度),采用Microsoft EXCEL軟件來分析所選定光譜區的數據,將光譜文件的Y軸坐標與標準圖譜的Y軸坐標進行比較,計算相關系數r。如果計算所得的樣品圖譜與標準圖譜峰型和峰位移值一致,并且兩者間相關系數大于0.95,則可認為鑒定的樣品與對照樣品結構一致; 反之,測試樣品與對照品結構不一致,譜圖相似性結果如表4。可以看出,9個不同批次的甘露聚糖肽供試品的核磁譜圖與對照品譜圖峰型及峰位移值幾乎完全一致,相關系數均大于0.96,說明該方法可以定性鑒別甘露聚糖肽樣品。

3.4方法學驗證

3.4.1特異性為了驗證方法的專屬性,在相同條件下測定了與甘露聚糖肽組成類似的葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖的核磁譜圖(圖4)。葡甘露聚糖的單糖組成同甘露聚糖肽相似,也是由葡萄糖和甘露糖兩種單糖組成,但連接方式目前認為是由葡萄糖和甘露糖通過β-1,4-吡喃糖苷鍵結合的雜多糖,在主鏈甘露糖C3位上存在著通過β-1,3鍵結合的支鏈結構[16]; 半乳甘露聚糖是由半乳糖和甘露糖構成的雜多糖,與甘露聚糖肽類似,糖鏈主鏈也是由甘露糖組成,但其結構是由β-1,4-D-甘露糖構成的主鏈上,通過α-1,6-糖苷鍵連接有單個的D-半乳糖分支[17]。可以看出,由于連接方式的差異,導致兩種甘露聚糖異頭氫區域的信號與甘露聚糖肽信號差異很大,兩者與甘露聚糖肽標準品的相關系數r僅有-0.280 1,-0.157 9(遠遠小于0.95),可見,該方法具有很強的特異性。

表4　供試品與對照品譜圖的相似度

1-Mannatide standard; 2-091202 (for oral);3-110901 (for oral);4-G100102 (for oral);5-131101 (for injection);6-131102 (for oral);7-131102 (for injection);8-140401 (for injection);9-140501(for injection);10-140502(for injection)

圖3甘露聚糖肽供試品1H-NMR疊加譜圖

(截取δ4.9 ～ 6.0區域)

Fig.3Overlay1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ4.9～6.0) of the tested mannatide

此外,在相同測定條件下,對市售的幾種其他多糖及糖肽類產品進行了核磁測定(圖5)。結果表明,幾種樣品在異頭氫區域峰型及峰位移值與甘露聚糖肽對照品譜圖差別更大,臘梅花粗多糖、云芝糖肽、板藍根糖肽的譜圖與甘露聚糖肽對照品譜圖的相關系數r分別只有0.560 4,0.045 7,-0.039 8(遠遠小于0.95),進一步說明該方法具有很高的特異性。

圖4　甘露聚糖肽(1)、葡甘露聚糖(2)和半乳甘露聚糖(3)的1H-NMR譜疊加圖(截取δ 4.9～6.0區域)Fig.4　Overlay 1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ 4.9～6.0) of mannatide(1),gluco- mannan(2) and galactomannan(3)

3.4.2重復性3份平行制備的甘露聚糖肽供試品溶液譜圖如圖6所示。可以看出,3個樣品譜圖各特征質子化學位移和峰型均一致,和對照品之間的相關系數分別為0.990 9,0.991 3,0.997 6,可見該方法具有較好的重復性。

3.4.3精密度同一甘露聚糖肽供試品于不同日期同一時間下測定,結果如圖7所示。各譜圖特征質子化學位移和峰型均一致,和甘露聚糖肽對照品之間的相關系數分別為0.991 1,0.994 8,0.990 5,可見該方法具有較高的日間精密度。

圖5　甘露聚糖肽(1)、板藍根糖肽(2)、云芝糖肽(3)和臘梅花 多糖(4)的1H-NMR疊加譜圖(截取δ 4.9～6.0區)Fig.5　Overlay 1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ 4.9～6.0) of mannatide(1),radix isatidis glyco- peptide(2),polysaccharopeptide(3),wintersweet flower polysaccharide (4)

圖6　三份平行制備的甘露聚糖肽供試品的1H-NMR譜圖 (截取δ 4.9～6.0區)Fig.6　Overlay 1H-NMR spectra (δ 4.9～6.0) of three parallel mannatide

圖7　甘露聚糖肽供試品不同日期檢測三次的1H-NMR譜圖 (截取δ 4.9～6.0區)Fig.7　Overlay 1H-NMR spectra (δ 4.9～6.0) of mannatide tested at three different days

4　結　論

采用核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽,以甘露聚糖肽標準品的1H-NMR譜作為標準圖譜,以異頭氫區作為特性鑒定的光譜區,將供試品譜圖與標準圖譜峰型及峰位移值對比,采用相關系數法計算選定光譜區的相似度。結果表明,該方法具有操作簡單、重復性好、特異性強、精密度高等優點,可以解決目前甘露聚糖肽現有質量標準中鑒別方法專屬性不強的問題,可為甘露聚糖肽的質量控制提供更好的手段。需要說明的是,如果樣品純度比較差,所含雜質在異頭氫區域也會出峰,則會對甘露聚糖肽的鑒定產生干擾。因此該方法只適合純度比較高的樣品。

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Identification of Mannatide by1H-NMR

XIA Wei1,SHEN Yan-hong1,FU Di1,ZHANG Wen-qing1,WAN Yan-fei2,ZHANG Li2

(1.Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Chengdu Lier Pharmaceutical Co.Ltd,Chengdu 610083,China)

1H-NMR method was established for identification of mannatide:A portion of the anomeric region of each spectrum (δ4.89～5.90) was selected as the “fingerprint” identification region.The tested samples spectra were compared with the standard reference spectrum of mannatide,using correlation coefficient to calculate the similarity.The specificity,repeatability and precision of this method were investigated.There was no significant difference between the tested samples spectra and reference spectrum,and the similarity was greater than 0.95.Methodological evaluation showed the specificity of1H-NMR identification method was satisfactory.The1H-NMR method established in this assay was simple,reproducible and specific,which was suitable for identification of mannatide.

1H-NMR; mannatide; identification

1006-3080(2016)04-0508-05

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.04.011

2015-12-17

夏瑋(1976-),女,江蘇鹽城人,副教授,博士,研究方向為天然產物的分離與分析。E-mail:xiawei1999@ecust.edu.cn

通信聯系人：張文清,E-mail:zhwqing @ecust.edu.cn

R927.11

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