甜柿果實總黃酮提取工藝的優化及其抗氧化研究

楊谷良，龍　濤，韓　露，王藝雅，李士明*

（1.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃岡438000；2.黃岡師范學院大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃岡438000）

甜柿果實總黃酮提取工藝的優化及其抗氧化研究

楊谷良1，2，龍濤2，韓露1，王藝雅1，李士明1，2*

（1.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃岡438000；2.黃岡師范學院大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃岡438000）

為確定羅田甜柿果實中總黃酮的最佳提取工藝條件及其抗氧化性，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken組合試驗設計、響應面優化試驗，得到柿果總黃酮提取的最佳條件：提取時間2.5 h，提取溫度75℃，乙醇體積分數75%，液料比13∶1（mL∶g）。在此條件下，柿果總黃酮的提取率為2.27%。柿果總黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為89.72%，證實柿果具有一定抗氧化性。

柿子；總黃酮；響應面法；抗氧化性

柿子（Diospyruskaki Thunb.）屬于柿屬柿科落葉果樹［1］，原產于我國長江流域及其以南地區，在我國至少有2 200年的栽培歷史［2］。2011年，我國柿樹栽培面積己達1.09×107畝，柿果產量達到3.259×109kg［3］。柿果中含有機酸、鞣質、多酚、糖類、維生素C、食用纖維、三萜酸，類胡蘿卜素以及類黃酮等多種有機物，具有抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降血脂、降膽固醇、軟化血管、健膚美容等生理作用［4］。柿葉和柿果等被加工成了柿葉茶［5］、柿子醋［6］、柿酒［7］、醋酸飲料［8］等。韓衛娟等［9］研究了15份柿葉中總黃酮含量的年動態變化，發現柿葉中總黃酮的含量為12.06～58.20 mg/g。黃酮類物質具有抗氧化、清除自由基和鰲合二價陽離子等廣泛的生物學效應［10］，林國榮等［11］也報道柿黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、擴張血管等生理功能。

黃酮的提取方法很多，如索式提取法、加熱提取法、有機溶劑提取法、酶法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等［12］。其中，有機溶劑提取法具有黃酮提取效率高、提取方法簡便、不需要復雜的儀器設備等優點。董江濤等［13］采用響應面法優化微波輔助提取柿葉中的總黃酮，柿葉黃酮的提取率達到6.15%。王恒超等［14］確定了微波輔助法提取柿黃酮最佳提取條件：乙醇體積分數70%、微波功率600W、提取時間150 s、料液比1∶30（g∶m L），黃酮提取量達到42.4 mg/g。周吳萍等［15］發現，當乙醇體積分數為50%，料液比為1∶60（g∶m L），提取溫度為90℃，提取時間45 m in，總黃酮的提取率可達7.59%。本研究利用乙醇溶液提取柿果實黃酮類化合物，通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實驗，確定提取柿果實總黃酮的最佳提取工藝并探討柿果總黃酮抗氧化活性，以期為柿子的綜合開發利用提供一定的實驗數據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甜柿果實：于2015年10月，在黃岡市羅田縣甜柿種植基地采集的近成熟果實。

蘆丁標準品（純度＞98%）：國藥集團化學試劑有限公司；DPPH：美國Sigma公司；無水乙醇、Al（NO3）3、NaOH、NaNO2、NaH2PO4、Na2HPO4、維生素C、甲醇、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

PB2002-10 Metter-Toledo Group電子天平：梅特勒-托利多國際有限公司；GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司；722S可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；RE-5220旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；HH-8電子恒溫水浴鍋：深圳國華儀器廠。

1.3方法

1.3.1柿果總黃酮的提取工藝

甜柿果實→除核→切片→烘干（65℃）→粉碎過80目篩→乙醇溶液浸泡提取→過濾→減壓蒸餾→總黃酮粗提物

1.3.2蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線的繪制：精密量取蘆丁標準溶液（0.1 mg/m L）0、1.00 m L、2.00 m L、3.00 m L、4.00 m L、5.00 m L分別置于25 m L容量瓶中，依次加入5 m L體積分數60%乙醇，1.0 m L 5%NaNO2，搖勻，放置5 min，加入1.0 m L 10% Al（NO3）3，搖勻，放置5 min，加入10 m L 4%NaOH，搖勻，再用體積分數60%乙醇定容，搖勻，放置15 m in，在波長510 nm處測定吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標，蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線。

1.3.3柿果總黃酮提取單因素試驗

設置提取時間：1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0h；提取溫度：70℃、75℃、80℃、85℃、90℃；乙醇體積分數：60%、70%、80%、90%、100%；液料比：9∶1、11∶1、13∶1、15∶1、17∶1（m L∶g）。取一定量的柿果粉末，經乙醇浸泡提取并過濾后，減壓蒸餾得提取物，提取物經體積分數50%乙醇溶解后，定容至100 m L。取上述溶液5 m L，用體積分數50%乙醇定容至50 m L后，取1 m L，加入0.15 m L濃度為5%的NaNO3溶液，充分搖勻后，靜置6 m in，然后加入2 m L含量為4%的NaOH溶液，加入體積分數70%的乙醇至總體積25 m L，搖勻后靜置15 min，測量波長510 nm處的吸光度值A。根據下面的公式計算出總黃酮提取率：

式中：y為通過回歸方程計算出的蘆丁含量，mg；50和20為稀釋倍數；N為100除以100 g柿鮮果干燥后的干粉質量；w為所稱取干粉的質量，mg。

1.3.4柿果總黃酮提取工藝的優化

表1　響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

根據單因素試驗結果，以提取時間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分數（C）和液料比（D）為評價因素，設計響應面試驗，因素與水平如表1所示。

1.3.5柿果總黃酮清除DPPH自由基能力的測定

參照鄭朋朋等［16］的方法。分別取0.1 m L不同質量濃度（50μg/m L、100μg/m L、150μg/m L、200μg/m L、250μg/m L）的總黃酮提取液，加入5 m L 100 μmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混勻并避光靜置30 min后，測定波長517 nm處的吸光度值，以提取溶劑為空白對照，以VC為陽性對照。DPPH清除率的計算公式如下：

式中：A0為空白溶液吸光度值；Ax為加入樣品后的體系吸光度值；Ax0為樣品本底吸光度值。

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線

以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標、波長510 nm處的吸光度（y）值為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，所得線性回歸方程為y=1.218 1x-0.004 3，相關系數R2= 0.996 4。表明在一定范圍內，吸光度值與蘆丁質量濃度間的線性關系良好。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.1.1提取時間對柿果總黃酮提取率的影響

圖2　提取時間對柿果總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids in persimmon

由圖2可知，在整個提取過程中，隨著提取時間的延長，柿果總黃酮的含量不斷增加。當提取時間＜2.5 h時，隨著提取時間的延長，總黃酮含量快速增加。這是因為隨著時間的延長，總黃酮逐漸被浸提出來。當提取時間繼續增加時，總黃酮含量的增加趨勢逐漸減緩，這是由于隨著時間的延長，大部分總黃酮被提取出來，而且，原料中的淀粉和蛋白質等物質也更多地釋放出來，提取液的黏度增大，增加后續離心、濃縮、過濾等的難度，提取效率降低。因此，2.5 h為適宜的提取時間。

2.1.2提取溫度對柿果總黃酮提取率的影響

圖3　提取溫度對柿果總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction tem perature on extraction rate of flavonoids in persimm on

由圖3可知，當提取溫度＜75℃時，柿果總黃酮的提取率隨著提取溫度的升高而不斷增加。當提取溫度＞75℃時，隨著提取溫度的升高，柿果總黃酮的提取率反而出現下降。因此，選擇75℃的提取溫度最為適宜。

2.1.3乙醇體積分數對柿果總黃酮提取率的影響

圖4　乙醇體積分數對柿果總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of e thanol concentration on extraction rate of flavonoids in persimmon

由圖4可知，乙醇體積分數60%～70%，隨著乙醇體積分數的增加，柿果總黃酮的提取率逐漸升高，但是，當乙醇體積分數＞70%以后，隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮含量逐漸降低。考慮到提取效率和提取成本，選擇體積分數70%的乙醇為宜。

2.1.4液料比對柿果總黃酮提取率的影響

圖5　液料比對柿果總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of flavonoids in persimm on

由圖5可知，當液料比9∶1～13∶1（m L∶g），隨著液料比的增加，柿果總黃酮的提取率逐漸增加，當液料比＞13∶1（m L∶g）時，柿果總黃酮的提取率開始下降，這是由于當液料比達到13∶1（m L∶g）時，柿粉末與提取液能夠充分接觸。進一步增大液料比，不會促進柿果總黃酮溶出，反而增加了后續離心、濃縮和過濾的難度，降低了柿果總黃酮的提取率。因此，液料比以13∶1（m L∶g）最適宜。

2.2響應面試驗結果與分析

通過Design-Expert軟件，以柿果總黃酮提取率（Y）為響應值，選取提取溫度（A）、乙醇體積分數（B）、液料比（C）和提取時間（D）4個因素，對柿果黃酮的提取條件進行了響應面分析。對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到柿果總黃酮提取率（Y）對A、B、C和D的二次多項回歸方程：

由表3可知，該回歸模型的F值為7.09，P=0.0004＜0.01，達到極顯著水平；失擬項的F值為15.40，P=0.069 0＞0.05，影響不顯著；方程的決定系數R2=0.996 3，表明響應值的變化有99.63%來源于所選變量，說明該模型擬合結果良好，試驗誤差小。對交互作用顯著的因素進行分析，得到響應曲面及等高線圖（見圖6）。

由圖6可知，因素對柿果總黃酮提取率的影響，以提取溫度最顯著，表現為曲線較陡，而提取時間的影響相對較小，表現為曲線較為平滑。

根據響應面分析結果，乙醇浸提法提取柿果黃酮的最佳工藝條件為提取時間2.73 h，提取溫度74.32℃，乙醇體積分數74.13%，液料比12.87 m L/g。在此條件下柿果黃酮的提取率為2.271%。

表2　柿果總黃酮提取工藝優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface ana lysis for persimm on flavonoids extraction process optim ization

表3　響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

圖6　提取時間、溫度、乙醇體積分數和液料比對柿果總黃酮提取率影響的響應曲面和等高線Fig．6 Response surface p lots and contour line of effects of extrac tion tim e，tem perature，ethanol concentration and liquid-solid ratio on persimmon flavonoids extraction rate

2.3驗證試驗

為了檢驗響應面法得到結果的可靠性，采用上述優化的提取條件進行乙醇浸提法提取柿果總黃酮的試驗。考慮到實際操作情況，將試驗條件修正為提取時間2.5 h，提取溫度75℃，乙醇體積分數75%，液料比13∶1（m L∶g）。在此條件下測試3次，柿果總黃酮的平均提取率為2.269%，實際值與理論值相近，可見該模型可以很好地反映各因素對柿果黃酮提取率的影響，同時也證明了用該方法研究柿果黃酮提取率的可行性。

2.4清除DPPH自由基的能力

圖7　不同質量濃度柿果總黃酮與VC清除DPPH自由基能力Fig.7 The scavenging capacity of different content of persimmon flavonoids and VC on DPPH free radical

由圖7可知，隨著柿果總黃酮質量濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸增強。當柿果總黃酮的質量濃度增加至0.25 mg/m L時，自由基清除率達到最大36.02%。和相同質量濃度的對照VC相比，柿果總黃酮的自由基清除率更強。結果說明柿果總黃酮具有較強的抗氧化能力。

3　結論

通過對提取時間、提取溫度、乙醇體積分數、液料比進行單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken組合試驗設計和響應面優化試驗，得到柿果總黃酮提取的最佳條件：提取時間2.5 h，提取溫度75℃，乙醇體積分數75%，液料比13∶1（m L∶g）。在此條件下，柿果黃酮的提取率為2.269%。建立的回歸方程擬合度良好，預測值檢測值基本一致。體外的抗氧化研究結果表明，柿果總黃酮具有較強的清除DPPH自由基能力，具有一定的抗氧化活性。

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Optim ization of extraction technology of total flavonoids from persimmon fruit and its antioxidant activities

YANG Guliang1，2，LONG Tao2，HAN Lu1，WANG Yiya1，LI Shim ing1，2*
（1.College of Life Science，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for the
Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China）

In order to optim ize extraction conditions of flavonoids from the fruit of Luotian non-astringent persimmon and its antioxidant activities，on the basis of single factor experiments，the optimum extraction conditions of persimmon flavonoids were obtained by Box-Behnken experiments and response surface methodology.The optimum extraction conditions were extraction time 2.5 h，temperature 75℃，ethanol concentration 75%，liquid-solid ratio1 13∶1（m l∶g）.Under the conditions，the extraction ratio of persimmon flavonoids was 2.27%，and the scavenging capacity of persimmon flavonoids on 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH）free radical was 89.72%，which confirmed that persimmon had certain antioxidant activities. Key words：persimmon；total flavonoids；response surface methodology；antioxidant activity

R285

0254-5071（2016）05-0081-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．017

2016-02-23

湖北省自科基金（2006ABA 186）；湖北省自科基金青年項目（Q200727004）；國家自然科學基金青年基金項目（31500995）作者簡介：楊谷良（1974-），男，副教授，博士，研究方向為農業資源開發與利用。

李士明（1963-），男，教授，博士，研究方向為功能食品與健康、疾病預防。