復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白表達作用的研究*

沈俊逸 方邦江凌 麗 陳振翼 王曉翠（上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032）

·研究報告·

復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白表達作用的研究*

沈俊逸 方邦江△凌 麗 陳振翼 王曉翠
（上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032）

目的 觀察復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白表達的干預作用。方法 120只健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組、治療組各30只。造模完成后，治療組予以復元醒腦湯，假手術組、模型組予以0.9%氯化鈉注射液，灌胃7 d。測定比較各組實驗大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的mRNA及蛋白表達水平。結果 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF三種基因及蛋白表達具有類似趨勢，由高到低依次為正常對照組、治療組、模型組及假手術組。正常對照組高于假手術組；治療組高于模型組（均P＜0.01）。結論 復元醒腦湯可上調SDF-1、CXCR4及VEGF的mRNA及蛋白表達水平，改善受損血管內皮功能及修復功能而促進局部血管再生和側支循環建立。

糖尿病腦梗死 復元醒腦湯 SDF-1 CXCR4 VEGF

【Abstract】Objective：To carry out the effect of Fuyuan Xingnao Decoction on the gene expression and protein secretion of SDF-1、CXCR4 and VEGF in diabetic cerebral infarction rats.Methods：Randomly all the enrolled healthy male SD rats were divided into 4 groups as Group C（control），Group AD（treated with placebo after acute cerebral infarction combined with diabetes mellitus），Group DM（diabetes mellitus without acute cerebral infarction）and Group AT （treated with Fuyuan Xingnao Decoction after acute cerebral infarction combined with diabetes mellitus）.After 7 day，the gene expression and protein secretion of SDF-1、CXCR4 and VEGF were measured in each samples.Results：Descendingly among all the groups the gene expression and protein secretion order of SDF-1，CXCR4 and VEGF were Group C，Group AT，Group AD and Group DM.Those of Group C were significantly overtopped than those of Group DM （P＜0.01）.Those of Group AT were significantly elevated in comparison with Group AD（P＜0.01）.Conclusion：Fuyuan Xingnao decoction can improve the gene expression and protein secretion of SDF-1、CXCR4 and VEGF in diabetic cerebral infarction rats，and then improve the vascular regeneration and the establishment of the collateral circulation.

【Key words】Fuyuan Xingnao Decoction；Diabetic cerebral infarction；SDF-1；CXCR4；VEGF

眾多研究表明糖尿病患者腦梗死發病率、致殘率及死亡率均較非糖尿病者高，機制尚不明確［1-7］。這給臨床治療及預防帶來很大困難。本實驗所用方藥復元醒腦湯是方邦江教授臨床常用的治療糖尿病并發腦梗死基礎方，經臨床驗證療效顯著。前期多項研究業已證實，復元醒腦湯能改善糖尿病腦梗死大鼠神經行為和缺血腦組織病理結構，降低腦系數、腦組織含水量、腦血管通透性而緩解腦水腫［8-10］。研究結果示，內源性內皮祖細胞（EPCs）具有修復缺血性腦損傷的能力［11］，而基質細胞衍生因子-1（SDF-1）及其高度特異性受體CXCR4、血管內皮生長因子（VEGF）等外源性細胞因子能夠促進內皮祖細胞的募集和動員［12］，從而促進缺血腦組織恢復以及血管新生。目前關于單純糖尿病血管病變或單純腦梗死SDF-1/CXCR4的研究眾多，而糖尿病并發腦梗死SDF-1/CXCR4變化的研究尚未見報道。本實驗從糖尿病并發腦梗死的分子生物學機制入手進行了研究，并對中醫中藥治療的作用機制進行了初步探討，以期為臨床治療及預防提供理論依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 120只SPF級雄性SD大鼠，體質量（250± 25）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，于上海中醫藥大學附屬龍華醫院科技樓實驗動物中心飼養，動物合格證號SCXK（滬）2011-009。

1.2 藥物 復元醒腦湯［人參10 g（單煎），三七10 g，石菖蒲12 g，水蛭10 g，益母草30 g，生南星15 g，制大黃9 g（后下）］，由上海市龍華醫院制劑室生產提供，生藥質量濃度為388 g/L。

1.3 儀器及試劑 1）凝膠成像儀GelDoc XR+，臺灣Amersham Pharmacia Biotech公司生產，熒光定量PCR儀、Applied Biosystems，北京Funglyn Biotech Incorporated生產；ABI 7900HT，大龍興創實驗儀器有限公司生產，BX51光學顯微鏡153714-709，日本Olympus生產；DP2-BSW攝像系統17267-617，日本Olympus生產；電泳儀164-5056，美國BIO-BAD公司生產；轉膜儀 170-3939，美國 BIO-BAD公司生產；酶標儀51119000美國Thermo公司生產；化學發光成像系統Bioshine ChemiQ，上海鷗翔科學儀器有限公司生產。2）多聚甲醛、水合氯醛，上海國藥集團化學試劑公司生產；STZ美國Sigma公司生產；PMSF，美國Amresco公司生產；RIPA裂解液，上海市碧云天生物技術有限公司生產；BCA蛋白分析試劑盒上海市碧云天生物技術有限公司生產；Actin抗體，美國CST公司生產；SDF-1抗體，美國CST公司生產；CXCR4抗體，美國CST公司生產；VEGF抗體，美國CST公司生產；HRP標記山羊抗兔IgG，美國Gibco公司生產；ECL化學發光試劑盒，美國Millipore公司生產；逆轉錄M-MLV1試劑盒（RT-PCR），美國Gibco公司生產；FastStart Universal SYBR Green，上海葉舟生物科技有限公司生產；TRI REAGENT RNA提取試劑盒，美國Molecular Research Center，Inc生產；引物合成引物，上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.4 模型制備［13］將STZ試劑溶于pH為4.6的檸檬酸鈉緩沖液中（現配現用），大鼠接受腹腔注射STZ試劑（50 mg/kg）［14］，1周后成模（血糖>16.7 mmol/L），并連續高脂飲食飼養2周。實施自體血栓栓塞性大鼠腦梗塞模型手術［15-16］，1）制作血栓：將模型組、治療組兩組糖尿病大鼠用10%水合氯醛溶液按30 mg/100 g劑量麻醉后［17］，先暴露其股靜脈，抽取靜脈血0.5 mL加入預先加有75 U凝血酶的EP管中，立即混勻。然后用注射器吸取沉淀部分注入2根頭皮針塑料管內，靜置15 min再打進盛有生理鹽水的培養皿中，洗掉凝血塊表面的紅細胞。在顯微鏡下選擇富含纖維素（深色）的血栓剪切成1～2 mm的小段，再轉入pH為7.4的PBS緩沖液中恒溫（37℃）靜置5 h使其凝縮，然后吸入EP50管中備用。2）制作腦梗死模型：將大鼠按前法麻醉后用眼科鑷子鈍性分離出左側頸總、頸內、頸外動脈。結扎頸外動脈，用動脈夾夾閉頸總動脈和頸內動脈，用提前制備好的一毫升注射器針頭（將頭處折1個90°的平鉤）在頸外動脈上挑刺出一個小口。將吸入血栓的EP50導管由頸外動脈插入頸內動脈，松開頸內動脈上的動脈夾。緩慢將血栓注入頸內動脈，用生理鹽水沖管后拔出EP50導管，結扎頸外動脈近心端。松開頸總動脈夾，縫合肌肉和皮膚。3）假手術組不將導管插入頸外動脈，其余操作與手術組相同，手術過程中控制動物肛溫在（37±0.5）℃。

1.5 分組及藥物干預 在常規適應性喂養后按照正常對照組30只、糖尿病組90只進行隨機分組的糖尿病組采用STZ腹腔注射法致糖尿病模型，造模成功后，連續高脂飲食飼養2周，再將糖尿病組按每組均等例數（每組30例）隨機分為糖尿病腦梗死組（模型組）、糖尿病腦梗死假手術組（假手術組）、糖尿病腦梗死治療組 （治療組），完成造模后，治療組每日按10.4 mL/（kg·d），每日2次，以復元醒腦湯灌胃（參照陳奇主編《中藥藥理實驗方法學》依實驗動物與人體表面積比計算），模型組、假手術組予以等量的生理鹽水灌胃，連續7 d后處死取材。

1.6 標本采集與檢測 1）腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF mRNA表達水平檢測：實驗結束后，模型組、假手術組、治療組分別給與10%水合氯醛深度麻醉后，快速斷頭取腦，剪開皮膚暴露頭及頸段，從頸椎處剪斷脊髓，剝離頸部肌肉，用止血鉗剔除顱骨，去除硬腦膜，迅速將腦組織100 mg放在液氮中冷凍。反復研磨成粉末，加入1 mL的TRI REAGENT RNA，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%酒精漂洗。DEPC水溶解RNA，反轉錄RNA為cDNA，進行定量PCR反應。引物的序列分別為：VEGF Front primer CCTGGCTTTACTGCTGTACCT，reverse primer GCTGGTAGACGTCCATGAACT；SDF-1 Front primer GCTCTGCATCAGTGACGGTA，Reverse primer AGGGCACAGT TTGGAGTGTT；CXCR4 Front primerGCACATCATGGTGGGTCTCA，Reverseprimer CCCCACGTAATACGGTAGCC；β-Actin Front primer CAAGTTCAACGGCAC AGTCA，Reverse primer CACCCCATTTGATGTTAGCG。2）腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF蛋白表達水平檢測：稱取模型組、假手術組、治療組30 mg腦組織，加入取500 μL的裂解液RIPA充分裂解，用BCA試劑盒定量蛋白。SDS page電泳，轉膜。孵育的一抗抗體SDF-1抗體，CXCR4抗體，VEGF抗體（1∶1000），4℃過夜 孵育二抗抗體（1∶5000），室溫1 h振蕩孵育，ECL法曝光顯影。

2 結 果

2.1 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達水平比較 見表1和圖1。結果示SDF-1、CXCR4、VEGF 3種基因與Actin的相對表達量由高到低依次為正常對照組、治療組、模型組及假手術組。其中正常對照組與假手術組比較各基因的表達量均具有統計學意義（P＜0.01）；治療組3種基因表達水平均高于模型組（均P＜0.01）；模型組與假手術組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達量比較（±s）

表1 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達量比較（±s）

與模型組比較，**P＜0.01；與正常對照組比較，△△P＜0.01。下同。

?

圖1 各實驗組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達量

2.2 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF蛋白表達水平比較 見表2和圖2，圖3。造模結束后，每組各取5只大鼠進行SDF-1、CXCR4、VEGF蛋白表達量檢測。圖2為 SDF-1、CXCR4、VEGF 3種蛋白的 Western Blot圖，進行灰度值掃描后得到了各蛋白與Actin的相對表達水平。由表2和圖3可見SDF-1、CXCR4、VEGF 3種蛋白與Actin的相對表達水平由高到低依次為正常對照組、治療組、模型組及假手術組。正常對照組與假手術組比較，差異有統計學意義 （均P＜0.01）；治療組中各蛋白的表達量均高于模型組（均P＜0.01）；模型組中各蛋白表達量均高于假手術組（均P＜0.01）。

表2 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的蛋白表達量比較（±s）

表2 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的蛋白表達量比較（±s）

與假手術組比較，##P＜0.01。

?

圖2 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF典型的蛋白表達量

圖3 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的蛋白表達量

3 討 論

本研究發現復元醒腦湯治療糖尿病腦梗死后大鼠的SDF-1、CXCR4和VEGF的基因表達與蛋白分泌均高于生理鹽水治療組。據報道EPCs具有修復缺血性腦損傷的能力［18］，SDF-1/CXCR4在腦缺血損傷后EPCs的“歸巢”中起著重要的調節作用［12］，而損傷局部VEGF的表達也對EPCs的“歸巢”起到相應的調節作用，從而增強缺血局部的神經和血管再生［19］；我們因此推測復元醒腦湯治療糖尿病腦梗死大鼠可能的分子機制在于直接提高或通過提高其調節因子SDF-1、CXCR4和VEGF的基因表達及蛋白分泌而間接提高了EPCs的細胞功能，從而增強缺血局部的神經和血管再生。

既往研究資料證實只有在病理狀態下SDF-1、CXCR4和VEGF 3種基因與蛋白才會有所表達和分泌［20-21］，這似乎與本實驗中正常對照組上述因子高的結果相悖；經過大量查閱文獻發現糖尿病機體的SDF-1、CXCR4及VEGF的基因表達及蛋白分泌是顯著下調的［22］，本實驗也得出同樣的結論。文獻亦報告了腦梗死機體SDF-1、CXCR4及VEGF基因與蛋白的表達與分泌是上調的［23-24］，因此推測在糖尿病腦腦梗死機體中，糖尿病對上述基因、蛋白的下調與腦梗死的上調聯合作用的結果是糖尿病的下調占了優勢，因此本實驗得出正常對照組基因表達與蛋白分泌高于假手術組的結果。此外以上基因、蛋白改變是否與時間有關本實驗未涉獵，可以通過進一步的實驗來驗證其確切變化趨勢及相關機制。

近年來，人們越來越多地關注糖尿病合并腦梗死的研究，在這些研究中，復方治療研究是最多的，這也表現了腦梗死疾病治療的主要方向。經過大量的實驗總結后，現在的大部分研究人員普遍認為糖尿病并發腦梗死中醫基本致病機是“氣陰兩虛、瘀痰阻絡”，“活血通絡”為糖尿病腦梗死的基本原則。由于糖尿病合并腦梗死是一個非常嚴重的病癥，該病致病機理以及治療手段不同于其他的一些疾病，因此在治療方案的運用中常是中西醫結合，利用中成藥復方治療本病的同時配合西醫降低血糖、改善體內細胞脫水等常規療法。總之，中醫治療糖尿病腦梗死有豐富的經驗和大量的實驗支持。

本研究從SDF-1/CXCR4、VEGF生物學軸對內皮祖細胞的調控，促進血管修復與新生的角度，探討復元醒腦湯促進糖尿病腦梗死缺血腦組織血管修復與新生的分子機制與有效作用靶點，是一個可行的全新思路與重要切入點。此外還從該角度對糖尿病腦梗死的作用機制進行了初步研究，為進一步深入明確糖尿病腦梗死確切機制奠定了理論基礎，其研究結果將有助于進一步加深對糖尿病腦梗死等血管并發癥病理機制的認識和防治水平的提高。

［1］ 李印肖，張月霞.腦梗死患者糖化血紅蛋白水平與頸動脈粥樣硬化的相關性分析［J］.臨床薈萃，2008，23（8）：1702-1703.

［2］ 史洪潤，楊玉慶，高昭水，等.高血糖對紅細胞聚集與急性腦梗死關系的研究［J］.中風與神經病雜志，1999，16（3）：161.

［3］ Slevin M，Krupinski J，Slowik A，et al.Serial measurement of vascular endothelil growth factor and transforming growth factor-β1 in serum of patients with acute ischemic stroke［J］.Stroke，2000，31（8）：1863-1870.

［4］ WW.FORE.Noninscelin dependent diabetes mullitas.The prevention of complication［J］.Med clin north Am，1995，79 （2）：287-298.

［5］ 余紅嵐，宋靜芳，王功娣.急性腦梗死患者炎癥因子與血脂、血尿酸水平的相關分析［J］.貴州醫藥，2009，33（2）：163-164.

［6］ 張建嶺.糖尿病患者與非糖尿病患者腦梗死的發病原因及預后比較［J］.河北北方學院學報，2007，24（2）：51-2.

［7］ 鄭關毅，林智穎，陳曉東，等.腦梗死患者辯證分型與自由基代謝的關系［J］.福建中醫藥，2004，35（6）：1-2.

［8］ 方邦江，周爽，沈俊逸，等.復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織血流量及含水量影響的實驗研究［J］.老年醫學與保健，2012，18（6）：381-384.

［9］ 趙平，沈俊逸，方邦江，等.復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織梗死體積的影響［J］.上海中醫藥大學學報，2013，9（5）：66-68.

［10］黃金陽，王宏，方邦江.復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠血-腦屏障干預作用的實驗研究［J］.江蘇中醫藥，2013，48 （8）：68-70.

［11］LL Chen，YF Liao，TS Zeng，et al.Number and function of circulating endothelial progenitor cell in diabetics with different vascular complications［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2009，89 （18）：1234-1239.

［12］GC Schatteman，HD Hanlon，C Jiao，et al.Blood-derived angioblasts accelerate blood-flow restoration in diabeticmice［J］.J Clin Invest，2000，106（4）：571-578.

［13］LJ Harris，P Zhang，H Abdollahi，et al.Availability of adipose-derived stem cells in patients undergoing vascular surgical procedures［J］.J Surg Res，2010，163（2）：105-112.

［14］LJ Harris，P Zhang，H Abdollahi，et al.Availability of adipose-derived stem cells in patients undergoing vascular surgical procedures［J］.J Surg Res，2010，163（2）：105-112.

［15］EZ Longa，PR Weinstein，S Carlson，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（2）：84-91.

［16］李浩，賈建平.大鼠大腦中動脈線栓法的改良與評價［J］.中風與神經病雜志，2006，12（23）：666-667.

［17］JM Capla，RH Grogan，MJ Callaghan，et al.Diabetes impairs endothelial progenitor cell-mediated blood vessel formation in response to hypoxia［J］.Plast Reconstr Surq，2007，119（1）：59-70.

［18］LL Chen，YF Liao，TS Zeng，et al.Number and function of circulating endothelial progenitor cell in diabetics with different vascular complications［J］.2006，13（25）：115-116.

［19］雙衛兵，王志慧，王東文，等.2型糖尿病大鼠模型的制備及其驗證［J］.山西醫科大學學報，2005，36（6）：275-279.

［20］李浩，賈建平.大鼠大腦中動脈線栓法的改良與評價［J］.中風與神經病雜志，2006，12（23）：666-667.

［21］N Ferrara，WJ Henzel.Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commum，1989，161（2）：851-858.

［22］黃波，劉學政，寵東渤.不同途徑注射鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的研究［J］.錦州醫學院學報，2003，24（1）：19-21.

［23］JB Bederson，LH Pitts，M Tsuji，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evalution of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［24］S Raffi，B Heissig，K Hottori.Efficient mobilization and recruitment of marrow-derived endothelial and hematopoietic stem cells by adenoviral vectors expressing angiogenic factors［J］.Gene Ther，2002，9（10）：631-641.

Experimental Study of Fuyuan Xingnao Decoction on the Gene Expression and Protein Secretion of SDF-1，CXCR4 and VEGF in Diabetic Cerebral Infarction Rats

SHEN Junyi，FANG Bangjiang，LING Li，et al.Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China

R285.5 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1457-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.001

國家自然科學基金項目（81273725）

（電子郵箱：fangbji@163.com）

2016-06-24）