以玉米淀粉廢水為反硝化碳源的污染物降解特征與微生物群落結構研究

郭曉婭，年躍剛*，閆海紅,2，殷勤,2，高鵬，陳光偉

1.中國環境科學研究院水污染控制技術研究中心，北京　100012 2.北京師范大學水科學研究院，北京　100875 3.中藍連海設計研究院，上?！?01204 4.中糧生化能源(公主嶺)有限公司，吉林 四平　136100

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以玉米淀粉廢水為反硝化碳源的污染物降解特征與微生物群落結構研究

郭曉婭1，年躍剛1*，閆海紅1,2，殷勤1,2，高鵬3，陳光偉4

1.中國環境科學研究院水污染控制技術研究中心，北京100012 2.北京師范大學水科學研究院，北京100875 3.中藍連海設計研究院，上海201204 4.中糧生化能源(公主嶺)有限公司，吉林 四平136100

反硝化；碳源；玉米淀粉廢水；三維熒光光譜；平行因子分析；微生物群落分析

廢水的脫氮效果很大程度上取決于廢水中反硝化碳源的含量及性能[1]。利用廢物作為有機碳源，不僅可以減少處理廢物的壓力，相對于目前開發的其他類碳源，如天然緩釋碳源[2-3]、人工降解材料[4-5]等，更能進一步降低處理成本，在污水處理中更具有實際意義。淀粉廢水有機物濃度高、毒性小[6]，且廢水中的有機物以易降解有機物為主，是培養微生物的理想介質[7-10]。

目前針對反硝化過程中有機物的降解特征主要采用CODCr和TOC濃度進行表征，較少涉及溶解性有機物(dissolved organic matter，DOM)的降解特征。對反硝化過程中的DOM進行分析，不僅能夠了解進出水的DOM信息，也能反映反硝化過程中DOM隨時間的變化規律。三維熒光光譜(excitation-emission matrix spectrum, EEMs)技術近年來被廣泛用于研究DOM熒光性質，其不僅能夠反映有機物的濃度，同時還可以提供有機物組成的信息[11]。但由于熒光峰之間的相互疊加，傳統的尋峰法以及區域積分法對重疊峰無法識別，2種方法均有一定的局限性。平行因子分析方法(parallel factor analysis，PARAFAC)是基于三線性數據分解理論，采用交替最小二乘法實現的數學模型[12]，可客觀識別出樣品中熒光峰的個數、種類及各熒光峰的熒光強度等信息，具有廣泛的應用前景。利用三維熒光光譜結合平行因子方法分析反硝化過程中DOM的降解特征，可以為反硝化反應器的底物投加提供理論和試驗基礎。

碳源種類是影響污泥菌群結構的重要因素[13]，然而淀粉廢水對反硝化脫氮的菌群結構影響卻鮮有報道。由于污泥中微生物群落組成復雜，試圖充分了解群落中微生物的結構往往比較困難，近年來高通量測序技術的快速發展為解決該問題提供了新的方法。借助高通量技術深度研究淀粉廢水作為碳源的微生物多樣性，有助于進一步研究反硝化過程的脫氮機理，對碳源的選擇和利用均有重要的指導作用。筆者分析了以玉米淀粉廢水處理過程中初沉池出水作為碳源時硝態氮和CODCr的降解過程，利用三維熒光光譜結合平行因子方法分析DOM的降解特征，并通過Illumina Hiseq 2500高通量測序技術分析廢水馴化污泥中的微生物多樣性，以期為淀粉廢水作為碳源的過程控制與資源化利用提供依據。

1　材料與方法

1.1廢水來源

廢水取自吉林省某大型玉米深加工企業，初沉池廢水水質指標：CODCr為12 234 mgL；TN濃度為631 mgL；TP濃度為161 mgL；濃度為24 mgL；濃度為2.3 mgL；濃度為4.9 mgL；pH為4.0。

1.2試驗方法

1.3分析方法

1.3.1常規指標分析方法

1.3.2三維熒光光譜分析方法

水樣經0.45 μm濾膜過濾后稀釋10倍，使用F-7000型三維熒光分光光度計采集樣品的熒光信號。發射波長為250～440 nm，激發波長為200～310 nm，激發與發射波長的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為12 000 nmmin。

在Matlab軟件上應用drEEM工具箱[14]對樣品的三維熒光數據進行平行因子分析。在應用模型之前，采用Delaunnay三角插值法去除拉曼和瑞利散射。結合核一致診斷法初步確定模型組分數，通過對半檢驗法來驗證模型的可靠性，確定組分數。

1.3.3微生物多樣性的測定

基因DNA的提取和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增：采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ngμL。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇16S V4區，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物(515F和806R)，New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR擴增。

文庫構建和上機測序：使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用Hiseq 2500 PE250進行上機測序。

生物多樣性與分類學分析：利用Uparse 軟件[15]對所有樣品的全部有效序列條數(Effective Tags)進行聚類，默認以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，篩選OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs代表序列進行物種注釋，用RDP Classifier方法[16]與GreenGene數據庫[17]進行物種注釋分析，并分別在界(kingdom)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)分類水平下統計樣本的群落組成。

2　結果與討論

2.1反硝化過程中硝態氮濃度和CODCr的變化

污泥培養穩定后，反硝化系統中硝態氮濃度和CODCr的變化如圖1所示。

圖1　反硝化過程中硝態氮濃度和CODCr變化Fig.1　Changes of the concentrations of nitrogen and CODCr in denitrification process

CODCr校準=CODCr檢測-8

由圖1可知，反硝化過程中CODCr的降解速率較穩定，在270 min內，從864 mgL快速下降至102 mgL，說明廢水中含有豐富的易降解有機物，可以被微生物快速利用。由于試驗完全以廢水作為碳源，實際工程廢水中含有一定量碳源，廢水僅作為補充碳源進行添加，廢水添加量可以進一步減少，并且缺氧反硝化工藝后通常設有好氧工藝，有機物可以被進一步降解，因此出水CODCr可以達到GB 8978—1996《污水綜合排放標準》一級標準(100 mgL)限值，進一步證明玉米淀粉廢水作為碳源的可行性。

2.2平行因子法解析反硝化過程

采用三維熒光光譜結合平行因子法分析反硝化過程中DOM的降解特征。利用核一致診斷法初步判斷模型組分，一般認為核一致值大于60%時組分數的選擇較合適。圖2為以初沉池出水作為反硝化碳源時組分數分別為2和3的核一致診斷法結果。組分數為2和3時，核一致值分別為99.87%和17.20%，因此初步擬定模型的組分數為2。

對半分析法是將數據庫分為幾個部分，通過檢驗各部分獲得的模型是否一致來判斷組分數的合理性，以排除單獨一個數據庫造成誤差的可能。將數據庫分解為A、B、C、D 4組，兩兩組合為1個半數據庫，驗證AB、CD、AC、BD、AD以及BC 6個半數據庫與總數據庫的組分在激發和發射波長的載荷同總數據庫的一致性。根據文獻[20]設定Matlab程序，即各組分的Tucker一致性系數大于0.95時可運行成功，否則運行錯誤。圖3為組分數為2時的對半分析結果。由圖3可見，當模型組分數為2時，各半數據庫與總數據庫的組分在激發和發射波長的載荷基本重合。當模型組分數為3時，程序無法運行成功，即數據庫各組分的Tucker一致性系數小于0.95，因此可以確定模型的組分數為2。

圖2　核一致法判斷模型組分數Fig.2　Model component estimation by the core consistency diagnostic

圖3　組分數為2時的對半分析結果Fig.3　The results of split-half analysis when there were two components

根據平行因子模型識別出初沉池出水作為碳源的反硝化系統中DOM的2個熒光組分及各組分的最大激發和發射波長，根據文獻[21-22]獲得對應的熒光物質類型，如表1所示。2個熒光組分的三維熒光光譜如圖4所示。

表1　反硝化過程中2個熒光組分特征

圖4　平行因子模型鑒別出的2個熒光組分Fig.4　Two fluorescence components identified by the PARAFAC model

以初沉池出水為碳源的反硝化過程中各組分熒光強度和總熒光強度隨時間的變化如圖5所示。

圖5　平行因子模型解析反硝化過程熒光強度變化Fig.5　Variation of fluorescence intensity against time identified by the PARAFAC model

由圖5可見，廢水中的熒光組分以組分1為主，隨著反硝化反應的進行，組分1的熒光強度以及總熒光強度在60 min之前呈小幅上升趨勢，這可能是由于加入廢水后，處于內源呼吸期的微生物為應對外界環境變化產生的代謝副產物所致。60 min之后，組分1的熒光強度迅速下降，直至消失，說明微生物可以快速利用廢水中的類絡氨酸。系統中組分2在初始時刻熒光強度較弱，隨著時間的推移，其熒光強度逐漸加強，且組分1與組分2熒光強度不顯著相關，因此可以認為組分2是反硝化過程中微生物代謝產生的類色氨酸副產物。

2.3微生物群落結構和多樣性

2.3.1污泥馴化前后綱水平下微生物群落結構

經初沉池廢水馴化過的二沉池活性污泥中，微生物群落在綱水平下的組成和相對豐度如圖6所示(僅列出相對豐度大于0.5%的綱類，相對豐度低于0.5%的綱類歸為其他)。經初沉池廢水馴化后，活性污泥中優勢種群種類基本不變，但微生物豐度明顯發生變化。其中，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)豐度顯著增加，由原二沉污泥中38.03%增加至59.34%。而β-變形菌綱的許多種類都已證明具有良好的反硝化能力[23]。

圖6　微生物群落在綱水平的組成和相對豐度Fig.6　Composition and relative abundance of microbial communities at the class level

2.3.2馴化污泥目水平下微生物群落結構

以初沉池廢水為碳源的反應器內有9種優勢菌群，其中，第一優勢菌群為未經培養菌種(uncultured bacterium)，相對豐度為18.54%。其次為伯克氏菌目(Burkholderiales)、紅環菌目(Rhodocyclales)和嗜氫菌目(Hydrogenophilales)，相對豐度分別為14.65%、14.13%和9.63%。這3類微生物均屬于β-變形菌綱。之后依次為梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)、Saprospirales、厭氧繩菌目(Anaerolineales)和假單孢菌目(Pseudomonadales)，相對豐度分別為8.14%、5.06%、2.93%、1.57%和1.23%。

3　結論

(2)利用三維熒光光譜結合平行因子方法分析反硝化過程中DOM的降解特征，識別出反硝化過程中的2個溶解性有機物的熒光組分，分別為類絡氨酸熒光組分〔組分1(230 nm310 nm、275 nm310 nm)〕和類色氨酸熒光組分〔組分2(220 nm350 nm、280 nm350 nm)〕。組分1的熒光強度隨時間先升高后降低，直至熒光峰消失；組分2熒光強度逐漸升高，推測組分2為微生物代謝過程中產生的副產物；總熒光強度隨時間呈先升高后逐漸降低的趨勢。

(3)經初沉池出水馴化后，污泥中的β-變形菌綱豐度明顯增加。目水平下三大優勢菌群(相對豐度在10%以上)為未經培養菌種(uncultured bacterium)、伯克氏菌目(Burkholderiales)和紅環菌目(Rhodocyclales)，相對豐度分別為18.54%、14.65%和14.13%。

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Pollutants Degradation Characteristics and Microbial Community Structure Using Cornstarch Wastewater as Denitrification Carbon Source

GUO Xiaoya1, NIAN Yuegang1, YAN Haihong1,2, YIN Qin1,2, GAO Peng3, CHEN Guangwei4

1.Research Center of Water Pollution Control Technology, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China 2.College of Water Science, Beijing Normal University, Beijing 100875，China 3.China Bluestar Lehigh Engineering Corporation, Shanghai 201204, China 4.COFCO Bio-chemical Energy(Gongzhuling) Company Limited, Siping 136100, China

denitrification; carbon source; cornstarch wastewater; excitation-emission matrix spectroscopy; parallel factor analysis; community structure

2016-03-07

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07202-009-01)

郭曉婭(1990—)，女，碩士研究生，主要研究方向為水污染控制與資源化，xiaoyaguo1990@163.com

*責任作者：年躍剛(1963—)，男，研究員，博士，主要從事生態修復、中水回用研究，nianyg@craes.org.cn

X703

1674-991X(2016)05-0427-07

10.3969j.issn.1674-991X.2016.05.063