粉末活性炭吸附-雙水相萃取法提純藻藍蛋白工藝研究

盛晶夢，張發宇，袁夢媛，汪家權

合肥工業大學資源與環境工程學院，安徽 合肥　230009

?

粉末活性炭吸附-雙水相萃取法提純藻藍蛋白工藝研究

盛晶夢，張發宇，袁夢媛，汪家權*

合肥工業大學資源與環境工程學院，安徽 合肥230009

采取粉末活性炭吸附-雙水相萃取的工藝方法，以巢湖新鮮藍藻藻泥為原料提純藻藍蛋白，在考慮煤質粉末活性炭添加量的基礎上，探究粉末活性炭純化藻藍蛋白的效果。通過單因素和正交試驗，確定粉末活性炭吸附-雙水相萃取法純化藻藍蛋白的最優工藝條件：PEG分子量為4 000做高聚物，PEG濃度為4%，磷酸鉀鹽濃度為16%，體系pH為7.0。驗證試驗結果表明，經過優化工藝純化后藻藍蛋白純度可達到3.461 7，組合工藝回收率為63%。與傳統方法相比，該工藝具有設備小、成本低、周期短等特點。

粉末活性炭；雙水相；提取純化；藻藍蛋白

巢湖的富營養化進程加劇、藍藻滋生，成為全國富營養化最為嚴重的淡水湖泊之一[1-3]。藍藻的資源化利用已經成為巢湖藍藻重點研究的課題[4]。目前，國內外對藍藻處理的研究主要集中在無害化處理和資源化利用方面，以制作有機肥料和發酵制沼氣為主[5-6]。但這2種方法的經濟效益較低，產品附加值不高，難以市場化推廣。近年來，利用藍藻生產高附加值產品——藻藍蛋白成為研究重點。

藻藍蛋白是一種重要的藻膽蛋白，呈藍色粉末狀，無毒，溶于水。研究表明，藻藍蛋白具有抗氧化性[7-8]、抗癌性[9]、抗炎性[10]、抗衰老性[11]、免疫熒光性[12-13]等特點。藻藍蛋白純度的高低決定了其應用和價值，純度越高，售價越高，根據藻藍蛋白純度的不同可將其分為食品級(純度>0.7)和試劑級(純度>4.0)[14]。

國內外對藻藍蛋白的提取純化工藝的研究有很多[15-20]，在細胞破碎和粗提階段多采用反復凍融法、超聲波破碎法或者二者相結合來破碎藻細胞，再用硫酸銨鹽析沉淀出粗蛋白；在精制階段，多為2種以上色譜技術的聯用或重復多次使用。這些工藝在推廣到實際工業化生產過程中往往具有操作步驟復雜、產量損失大、能耗高、周期長等問題[21]。粉末活性炭吸附法具有效果穩定、成本低等特點，多用于水處理工藝中，有關活性炭及與其他方法聯合應用純化藻藍蛋白的研究卻很少[22]。而雙水相萃取技術作為近年來發展較快的新技術，在生物質純化過程中應用較多[21]。筆者采用粉末活性炭粗提-雙水相萃取的組合工藝提純藻藍蛋白，該方法具有操作簡單、試驗周期短、藻藍蛋白純化效率高的特點，對于藻藍蛋白規模化生產具有十分重要的借鑒意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

藍藻原料采用實驗室冷柜中儲存的巢湖新鮮藍藻藻泥，取自西湖區水華表層20 cm水體處，含水量約為96.2%，采集日期為2015年8月4日，室外溫度37～38 ℃。

試劑：煤質粉末活性炭(廣州市鴻生炭業化工有限公司)、鹽酸(HCl，上海博河精細化學品有限公司)、氫氧化鈉(NaOH，西隴化工股份有限公司)、聚乙二醇1000(PEG 1000，上海凌峰化學試劑有限公司)、聚乙二醇2000(PEG 2000，天津市致遠化學試劑有限公司)、聚乙二醇4000(PEG 4000，天津市光復精細化工研究所)、聚乙二醇6000(PEG 6000，西隴化工股份有限公司)、磷酸鉀鹽(KH2PO4和K2HPO4，天津市致遠化學試劑有限公司；KH2PO4與K2HPO4的質量比為1∶1.85)。

1.2儀器與設備

1.3分析方法

粉末活性炭粗提后藻藍蛋白存在于上清液中，雙水相萃取后藻藍蛋白富集于體系上相高聚物中。將藻藍蛋白溶液在波長為200～700 nm下進行紫外光譜掃描，藻藍蛋白的純度參考Herrera等[23]推薦的公式，藻藍蛋白的濃度參考Soni等[24]推薦的公式。并計算出上清液中藻藍蛋白的回收率和雙水相上相中藻藍蛋白的得率。

藻藍蛋白純度(P)=A620A280

藻藍蛋白濃度(C)=(A620-0.7×A650)7.38

藻藍蛋白回收率(Y活)=(CtVtC0V0)×100%

雙水相上相中藻藍蛋白得率(Y雙)=

CAVA(CAVA+CBVB)×100%

式中：A280、A620和A650分別為波長280、620和650 nm處的吸光度；Ct為上清液中的藻藍蛋白濃度；C0為粗提液中的藻藍蛋白濃度；CA為雙水相上相中藻藍蛋白濃度；CB為雙水相下相中藻藍蛋白濃度；Vt為樣品溶液的體積；V0為粗提液的體積；VA為雙水相上相溶液的體積；VB為雙水相下相溶液的體積。

1.4制備藻藍蛋白粗提液

取-4 ℃下冷凍保存的巢湖新鮮藍藻藻泥在室溫(25 ℃)下融解，完成一次凍融破壁。重復該過程3次，將解凍后的藍藻溶液用4層普通紗布過濾去除藻渣，所得溶液于4 ℃、8 000 rmin下離心20 min后取上清液，即得到藻藍蛋白粗提液。

1.5藻藍蛋白提純

室溫(25 ℃)條件下，取藻藍蛋白粗提液20 mL，將適量粉末活性炭與粗提液充分攪拌10 min，離心取上清液，測定并計算溶液中藻藍蛋白的純度和回收率。將粉末活性炭處理后的上清液移入燒杯中置于磁力攪拌器上，向燒杯中逐步加入適量PEG和磷酸鉀鹽，并用去離子水調節，使雙水相體系總質量為30 g，充分攪拌均勻使PEG和磷酸鉀鹽全部溶解后將溶液移入離心管，在4 ℃、6 000 rmin下離心1 min以加速體系分層，分別吸取雙水相體系上下相，測定上下相體積、上下相中藻藍蛋白純度與濃度，計算藻藍蛋白回收率和雙水相體系分配系數。

1.6藻藍蛋白光譜分析

分別將藻藍蛋白粗提液和純化后的藻藍蛋白溶液用去離子水稀釋至25倍，用紫外可見分光光度計在波長為200～700 nm進行全波段掃描。

2　結果與討論

2.1粉末活性炭粗提藻藍蛋白條件優化

前期試驗發現，粉末活性炭添加量對其純化藻藍蛋白的效果影響最為顯著，因此在前期試驗的基礎上，重點研究粉末活性炭添加量對藻藍蛋白純化效果的影響，結果如圖1所示。

圖1　粉末活性炭添加量對藻藍蛋白純度和回收率的影響(25 ℃)Fig.1　Effect of powered activated carbon dosage on C-phycocyanin purity and recovery(25 ℃)

由圖1可知，隨著粉末活性炭添加量的增加，藻藍蛋白的純度先增加后減少，而回收率則持續下降。這可能是由于隨著粉末活性炭添加量的增加，中孔和大孔的比例增加、容積增大，對藻藍蛋白的不可逆吸附逐漸增強，從而使藻藍蛋白的損失量逐漸大于粉末活性炭對雜質蛋白的吸收量。綜合考慮純度和回收率，粉末活性炭的添加量定為100 gL，此時藻藍蛋白的純度為1.849 4，回收率為62%，溶液呈清亮的藍色。

2.2雙水相萃取藻藍蛋白條件優化

2.2.1高聚物分子量的確定

設定磷酸鉀鹽濃度為20%，體系pH為7.0，PEG濃度為10%，取分子量分別為1 000、2 000、4 000、6 000的PEG進行雙水相萃取試驗，測定上下相體積、上下相中藻藍蛋白純度與濃度，計算藻藍蛋白回收率和雙水相體系分配系數，結果見圖2。

圖2　PEG分子量對藻藍蛋白萃取效果的影響Fig.2　The effect of PEG formula weight on C-phycocyanin extraction

由圖2可知，隨著PEG分子量的增加，藻藍蛋白的純度、回收率和分配系數均先增加后減少。藻藍蛋白的純度和回收率在PEG分子量為4 000時達到最大值，而分配系數則在PEG分子量為2 000時達到最大值。原因可能是隨著PEG分子量的增加，上相的疏水性也增加，親水性的藻藍蛋白便轉向下相。綜合考慮回收率、分配系數和純度3項指標，選取PEG分子量為4 000作為雙水相萃取最優條件之一。

2.2.2PEG濃度的確定

設定磷酸鉀鹽濃度為20%，體系pH為7.0，PEG分子量為4 000，PEG濃度為2%～14%進行雙水相萃取試驗，結果如圖3所示。

圖3　PEG 4000濃度對藻藍蛋白萃取效果的影響Fig.3　The effect of PEG 4000 concentration on C-phycocyanin extraction

由圖3可知，隨著PEG濃度的增加，藻藍蛋白的純度和分配系數緩慢下降，回收率一直處于較高水平且保持穩定。這是由于隨著PEG濃度的增加，上相的黏稠度也逐漸增加，分子阻力增大，導致藻藍蛋白越難以進入上相。綜合考慮回收率、分配系數和純度3項指標，選取PEG濃度為6%作為雙水相萃取最優條件之一。

2.2.3磷酸鉀鹽濃度的確定

設定PEG 4000濃度為6%，體系pH為7.0，磷酸鉀鹽濃度為12%～24%進行雙水相萃取試驗，結果見圖4。

圖4　磷酸鉀鹽濃度對藻藍蛋白萃取效果的影響Fig.4　The effect of potassium phosphate concentration on C-phycocyanin extraction

由圖4可知，隨著磷酸鉀鹽濃度的增加，藻藍蛋白的純度緩慢下降，分配系數緩慢提高然后降低，回收率一直處于較高水平且保持穩定。這可能是由于隨著磷酸鉀鹽濃度的升高，下相鹽析的作用增加，藻藍蛋白及其他雜蛋白向上相遷移；而當磷酸鉀鹽濃度過高時，藻藍蛋白被部分或全部析出，上相分配系數下降。綜合考慮回收率、分配系數和純度3項指標，選取磷酸鉀鹽濃度為16%作為雙水相萃取最優條件之一。

2.2.4體系pH確定

設定PEG 4000濃度為6%，磷酸鉀鹽濃度為16%，分別調節體系pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0進行雙水相萃取試驗，結果見圖5。

圖5　pH對藻藍蛋白萃取效果的影響(25 ℃)Fig.5　The effect of pH on C-phycocyanin extraction

由圖5可知，隨著體系pH的增加，藻藍蛋白的純度和分配系數先增后減，在pH為7.0時均達到最大值；藻藍蛋白的回收率則一直保持在較高水平且基本不變。這是由于pH會改變藻藍蛋白分子、成相分子和相界面的電性，從而改變藻藍蛋白在上下相的分配；當體系pH為7.0時，藻藍蛋白表面所帶的靜電荷幾乎為0，與PEG之間的作用最強。綜合考慮藻藍蛋白的純度、分配系數和回收率3項指標，選擇體系pH為7.0作為雙水相萃取的最優水平之一。

2.2.5雙水相萃取正交試驗

以PEG分子量、PEG濃度、磷酸鉀鹽濃度和體系pH為正交試驗的4個因素，根據之前單因素試驗的結果來確定每個因素合適的4個水平，按照L16(44)建立正交試驗表進行試驗，試驗水平設置和結果見表1，直觀分析結果見表2。

表1　雙水相萃取正交試驗結果

(續表1)

表2　雙水相萃取正交直觀分析

根據表2可知，因素A、D關于3個指標的優水平是一致的，所以可以直接作為最優水平；而因素B對于純度和分配率2個指標的影響次序均為第一、優水平均為B1，對于回收率指標的影響次序為第二、優水平為B2，考慮試驗指標k值減少最小原則，B因素的優水平確定為B1；同樣，C因素的優水平確定為C2。綜合衡量評價所有指標優組合，最終確定雙水相萃取藻藍蛋白最優工藝條件為A3B1C2D2。

在優化條件下驗證試驗結果表明:雙水相萃取后，藻藍蛋白的純度為3.461 7，組合工藝綜合回收率為63%。丙瀟瀟[25]用PEG 1000與硫酸銨組成的雙水相體系純化藻藍蛋白粗提液，藻藍蛋白的純度僅能由0.57升至1.00，回收率為97.2%。由此可見，本研究所得粉末活性炭粗提-雙水相萃取工藝具有設備小、成本低、操作周期短等特點，對藻藍蛋白市場化推廣具有實際指導意義。

3　結論

采用粉末活性炭吸附-雙水相萃取法提純藻藍蛋白，通過對粉末活性炭添加量和雙水相萃取條件進行優化試驗，得出最優工藝條件：粉末活性炭添加量為100 gL，PEG 4000濃度為4%，磷酸鉀鹽濃度為16%，雙水相體系pH為7.0。在最優工藝條件下，純化后的藻藍蛋白純度可達3.461 7，提純效果遠好于僅使用雙水相萃取藻藍蛋白粗提液。由此可見，將粉末活性炭吸附法與雙水相萃取法聯合應用能夠達到進一步純化藻藍蛋白的目的，且操作簡單，純化效率高。

[1]張民,孔繁翔.巢湖富營養化的歷程、空間分布與治理策略:1984—2013年[J].湖泊科學,2015,27(5):791-798.

ZHANG M,KONG F X.The process, spatial and temporal distributions and mitigation strategies of the eutrophi-cation of Lake Chaohu:1984-2013[J].Journal of Lake Sciences,2015,27(5):791-798.

[2]王書航,姜霞,金相燦.巢湖水環境因子的時空變化及對水華發生的影響[J].湖泊科學,2011,23(6):873-880.

WANG S H,JIANG X,JIN X C.Spatial-temporal variations of aquatic environmental factors and their influences to algal blooming in Lake Chaohu[J].Journal of Lake Sciences,2011,23(6):873-880.

[3]安徽省環境保護廳.2012年安徽省環境狀況公報[R].合肥:安徽省環境保護廳,2013.

[4]金相燦,屠清瑛.湖泊富營養化調查規范[M].北京:中國環境科學出版社,1990.

[5]沈銀武,劉永定,吳國樵,等.藍藻有機無機復混肥對幾種作物的增效試驗[J].水生生物學報,2005,29(4):399-405.

SHEN Y W,LIU Y D,WU G Q,et al. Efficiency test on organic and inorganic fertilizes with cyanobacteria(Microcystis) in several crops[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2005,29(4):399-405.

[6]翟志軍,馬歡,李軍,等.巢湖藍藻產沼氣的試驗研究[J].安徽農業科學,2008,36(12):5084-5087.

ZHAI Z J,MA H,LI J,et al.Study on the production biogas with blue algae from Chaohu Lake[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2008,36(12):5084-5087.

[7]汪興平,謝筆均,潘思軼,等.葛仙米藻藍蛋白抗氧化作用研究[J].食品科學,2007,28(12):458-461.

WANG X P,XIE B J,PAN S Y,et al. Study on antioxidation activities of phycocyanin fromNostocsphaeroidsKutz[J].Food Science,2007,28(12):458-461.

[8]楊立紅,王曉潔,鐘旭升,等.魚腥藻藻藍蛋白的抗氧化作用[J].食品科學,2006,27(12):208-212.

YANG L H,WANG X J,ZHONG X S,et al.Detecting the anti-oxidative effect of anabaena phycocyanin[J].Food Science,2006,27(12):208-212.

[9]王勇,錢峰,錢凱先,等.藻藍蛋白抗癌活性研究[J].浙江大學學報(工學版),2001,35(6):672-675.

WANG Y,QIAN F,QIAN K X,et al.Anticancer activity of phycocyanin[J].Journal of Zhejiang University(Engineering Science),2001,35(6):672-675.

[10]ROMAY C,GONZALEZ R,LEDON N,et al.C-phycocyanin:a biliprotein with antioxidant,anti-inflammatory and neuroprotective effects[J].Current Protein and Peptide Science,2003,4(3):207-216.

[11]趙艷景,湯云成.條斑紫菜藻藍蛋白的分離純化及其抗衰老作用研究[J].食品科學,2012,33(17):94-97.

ZHAO Y J,TANG Y C. Separation, purification and anti-aging activity of phycocyanin fromPorphyrayezoensis[J].Food Science, 2012,33(17):94-97.

[12]李濟平.藻藍蛋白對免疫系統的活性的研究[J].中國公共衛生,2000,16(7):647-648.

[13]吳萍.藻膽蛋白與熒光免疫分析[J].生理科學進展,2000,31(1):82-84.

[14]RITO-PALOMARES M,NUNEZ L,AMADOR D.Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for C-phycocyanin recovery fromSpirulinamaxima[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001,76(12):1273-1280.

[15]張發宇,趙冰冰,蔡靜,等.鹽析法純化新鮮藍藻中藻藍蛋白工藝條件的研究[J].環境工程技術學報,2015,5(6):499-503.

ZHANG F Y,ZHAO B B,CAI J,et al.Research on technology conditions of purifying phycocyanin from fresh algae using salt precipitation[J].Journal of Environmental Engineering Technology,2015,5(6):499-503.

[16]蔡春爾,何培民.高速離心對藻膽蛋白提取純化的影響[J].中國醫藥雜志,2006,6(8):844-847.

[17]MORAES C C,KALIL S J.Strategy for a protein purification design using C-phycocyanin extract[J].Bioresource Technology,2009,12:5312-5317.

[18]沈強,沈銀武,劉永定,等.滇池水華藍藻藻藍蛋白的分離純化與毒性研究[J].環境化學,2009,28(4):497-500.

SHEN Q,SHEN Y W,LIU Y D,et al.Studies on purification and toxicity of phycocyanin from waterbloom forming cyanobacteria in Dianchi Lake[J].Environmental Chemistry,2009,28(4):497-500.

[19]郝俊,王建中,呼曉妹.超聲波輔助提取螺旋藻藻膽蛋白的工藝探討[J].食品工業科技,2007,28(2):170-172.

[20]林紅衛,覃海錯,伍正清,等.鈍頂螺旋藻中藻藍蛋白的提取純化新工藝[J].精細化工,1998,15(1):18-20.

LIN H W,QIN H C,WU Z Q,et al.A new extraction and purification method for phycocyanins from Spirulina[J].Fine Chemicals,1998,15(1):18-20.

[21]馮維希,岳岑,黃文.雙水相技術分離純化藻膽蛋白的研究進展[J].食品研究與開發,2010,31(12):246-249.

FENG W X,YUE C,HUANG W.Research progress on auqeous two phase extraction for purification of phycobiliprotein[J].Food Research and Development,2010,31(12):246-249.

[22]廖曉霞,張學武.高效分離藻藍蛋白新方法[J].食品工業科技,2011,32(6):273-280.

[23]HERRERA A,BOUSSIBA S,NAPOLENONE V,et al.Recovery of phycocyanin from the cyanobacteriumSpirulinamaxima[J].Journal of Applied Phycology,1989,1(1):325-331.

[24]SONI B,KALAVADIA B,TRIVEDI U,et al.Extraction,purification and characterization of phycocyanin formOscillatoriaquadripunctulata-isolate form the rocky shores of Bet-Dwarka,Gujarat,India[J].Process Biochemistry,2006,41(9):2017-2023.

[25]丙瀟瀟.藻膽蛋白的雙水相綠色提取技術[D].哈爾濱:哈爾濱工業大學,2010. ?

何緒文，王宇翔，房增強,等.鉛鋅礦區土壤重金屬污染特征及污染風險評價[J].環境工程技術學報,2016,6(5):476-483.

HE X W, WANG Y X, FANG Z Q, et al.Pollution characteristics and pollution risk evaluation of heavy metals in soil of lead-zinc mining area[J].Journal of Environmental Engineering Technology,2016,6(5):476-483.

Study on Extraction and Purification of C-phycocyanin by Combined Use of Powdered Activated Carbon Treatment and Aqueous Two-phase Extraction from Cyanobacteria

SHENG Jingmeng, ZHANG Fayu, YUAN Mengyuan, WANG Jiaquan

School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

Extraction and purification of C-phycocyanin were performed by the combined use of powdered activated carbon (PAC) treatment and aqueous two-phase extraction from fresh Cyanobacteria mud in Chaohu Lake. Firstly, the effects of PAC on purification of C-phycocyanin were studied by considering the dosage of powdered activated carbon. Then, the single factor and orthogonal experiments were conducted to determine the optimum conditions in the PAC treatment and aqueous two-phase purification, which were PEG 4000 as polymer, the PEG 4000 concentration 4%, the potassium phosphate concentration 16% and pH 7.0. The verification test showed that after the purification by the optimized process, the purity and recovery rate of C-phycocyanin could reach to 3.461 7 and 63%, respectively. It was with less equipment requirements, lower cost and shorter time, etc., compared with traditional methods.

powdered activated carbon; aqueous two-phase extraction; extraction and purification; C-phycocyanin

2016-02-27

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07103-004)

盛晶夢(1991—)，女，碩士研究生，研究方向為環境污染控制工程，abbylw2015@163.com

*責任作者：汪家權(1957—)，男，教授，研究方向為水處理技術，jiaquan.wang@163.com

X703

1674-991X(2016)05-0469-07

10.3969j.issn.1674-991X.2016.05.069