101份中國甘蔗主要育種親本褐銹病抗性鑒定及Bru1基因的分子檢測

李文鳳 王曉燕 黃應昆張榮躍 單紅麗 羅志明 尹 炯

云南省農業科學院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室， 云南開遠 661699

101份中國甘蔗主要育種親本褐銹病抗性鑒定及Bru1基因的分子檢測

李文鳳 王曉燕 黃應昆*張榮躍 單紅麗 羅志明 尹 炯

云南省農業科學院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室， 云南開遠 661699

由黑頂柄銹菌引起的甘蔗褐銹病是一種重要的世界性甘蔗病害， Bru1是甘蔗抗褐銹病主效基因， 該基因對不同地區的褐銹病分離物具有廣譜抗性。為明確中國甘蔗主要育種親本對黑頂柄銹菌的抗性水平， 了解Bru1基因在這些親本中的分布情況， 本研究于2014年對中國國家甘蔗種質資源圃保存的101份甘蔗主要育種親本進行苗期抗褐銹病鑒定和抗褐銹病基因Bru1的分子檢測。結果顯示， 供試親本中， 共48份抗病材料含有抗褐銹病基因Bru1， 頻率為47.5%， 表明中國甘蔗主要育種親本中褐銹病抗性主要由 Bru1控制； 其余 29份抗病材料和 24份感病材料均不含抗褐銹病基因Bru1， 暗示除了 Bru1外， 可能還有其他抗褐銹病基因存在。研究結果為深入開展甘蔗抗褐銹病育種， 選育和推廣優良抗病品種， 有效防控甘蔗褐銹病提供了科學依據和優良抗性親本。

甘蔗； 主要育種親本； 抗褐銹病基因Bru1； 分子檢測

甘蔗銹病是世界性的甘蔗重要病害之一， 其病原主要有黑頂柄銹菌Puccinia melanocephala H. Sydow & P. Sydow.和屈恩柄銹菌Puccinia kuehnii Butler.［1-2］。后者發生在美國、澳大利亞、印度、拉丁美洲等國家或地區［3］， 而中國大陸至今尚未見有關該菌發生的報道。

黑頂柄銹菌廣泛分布于爪哇、古巴、牙買加、澳大利亞、美國、墨西哥、印度、泰國、毛里求斯等植蔗國家或地區， 并多次爆發流行， 給蔗糖產業造成極大的經濟損失［2，4-6］。在中國大陸， 阮興業等［7］于1982年首次報道了黑頂柄銹菌在云南蔗區的發生， 之后福建、廣東、四川、江西、廣西、海南等蔗區也先后報道［8-12］。目前， 由黑頂柄銹菌引起的甘蔗褐銹病已成為中國蔗區發生最普遍， 危害最嚴重的病害之一， 造成甘蔗種質退化、產量降低［8-9］。尤其近年， 中國蔗區主栽的一批豐產高糖品種如桂糖15、桂糖17、桂引9號、P44、臺糖86-1626、粵糖60、德蔗03-83、福農1110等主推新品種， 因其高度感染褐銹病而面臨淘汰，極大地影響了我國蔗糖產業的持續健康穩定發展［12］。

選育和種植抗病品種是防治甘蔗褐銹病最經濟有效的措施［13-15］， 其中評價和篩選抗性親本并科學選配， 對選育抗褐銹病品種至關重要。目前， 國外研究人員已在栽培品種 R570上發現和定位甘蔗抗褐銹病主效基因Bru1［16-17］， 位于甘蔗第7條染色體0.42 cM區域內， 并與高粱第4染色體大約在225 kb區域及水稻第2染色體的短臂上600 kb區域具有同線性［18］， 該基因被證實對來自不同國家地區的褐銹病分離物具有廣譜抗性［19］， 現已開發出與Bru1密切相關的2個分子標記用于種質鑒定［20］。本課題組前期采用這2個分子標記從31份甘蔗野生核心種質資源中檢測篩選到含有抗褐銹病基因 Bru1的8份野生核心種質資源， 為有效開展甘蔗抗褐銹病育種提供了優良抗源種質和參考依據［21］。但是， 迄今為止， 對中國甘蔗主要育種親本尚未進行過抗褐銹病鑒定和抗褐銹病基因標記選擇，抗褐銹病育種親本選配存在盲目性。為此， 本研究對中國國家甘蔗種質資源圃保存的101份甘蔗主要育種親本進行苗期抗褐銹病鑒定和抗褐銹病基因 Bru1的分子檢測， 了解Bru1 基因在甘蔗主要育種親本中的分布狀況， 篩選含有目標基因的抗性親本， 以期為選育和利用抗病品種有效防控甘蔗褐銹病提供科學依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

除中國國家甘蔗種質資源圃保存的的101份甘蔗主要育種親本（表2）外， 選用含Bru1基因抗病對照品種新臺糖1號、新臺糖9號［20］和模式品種 R570［16］， 感病對照品種印度290、選蔗3號。

1.2苗期抗褐銹病鑒定

2014年4月在云南省農業科學院甘蔗研究所（中國云南開遠）， 用直徑35 cm、高30 cm的塑料桶種植各材料，桶內裝入2/3的土壤和有機質（3∶1）， 每份材料種植4桶，4次重復， 每桶5株， 共20株， 隨機排列， 常規管理。

于2014年7月28日甘蔗褐銹病發生盛期， 從云南勐海發病蔗區高感品種選蔗 3號采集黑頂柄銹菌孢子直接用于接種。于2014年7月30日參照文獻［21］報道的方法配制接種液， 進行噴霧接種和管理。接種后4～5周調查供試材料發病情況； 參照文獻［22］的抗性鑒定評價標準。

1.3抗褐銹病基因Bru1的分子檢測

參照Costet等［20］甘蔗抗褐銹病基因Bru1的PCR標記R12H16和 9O20-F4引物， 委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。R12H16標記預期擴增產物長度為570 bp，9O20-F4標記預期擴增產物長度為200 bp。

分別采集各材料充分展開的第一片新葉提取總DNA，以抽提的葉片總 DNA為模版， 參照文獻［21］的方法對各材料進行PCR擴增檢測。

2　結果與分析

2.1苗期人工接種鑒定抗病性

101份供試材料中， 1級高抗至3級中抗的有77份， 占76.2%，。其中65份材料表現1級高抗， 占64.4%， 8份材料表現 2級抗病， 占 7.9%， 4份材料表現 3級中抗， 占4.0%； 24份材料表現為4級中感到9級高感2， 占23.8%（表1）。

2.2抗褐銹病基因Bru1的PCR檢測

分別用R12H16標記和9O20-F4標記引物對感病對照印度290、選蔗3號和含Bru1抗病對照新臺糖1號、新臺糖9號、模式品種R570的DNA進行PCR擴增檢測和酶切檢測。結果顯示， 含Bru1抗病對照新臺糖1號、新臺糖9號、模式品種R570均分別穩定擴增出2個標記的特異性條帶， 而感病對照印度290、選蔗3號未擴出特異性條帶（圖1）， 各樣品重復檢測結果一致。

圖1　3個已知含抗Bru1的抗性品種和2個感病對照PCR擴增和酶切結果Fig. 1 PCR results and digestion of three sugarcane varieties carrying Bru1 and two susceptible varietiesA： R12H16-PCR標記； B： 9O20-F4-PCR-Rsa1標記； M： Marker； R1～R3： 已知含Bru1的抗病品種新臺糖1號、新臺糖9號和含Bru1模式品種R570； S1～S2： 感病品種印度290、選蔗3號。A： R12H16-PCR marker； B： 9O20-F4-PCR-Rsa I marker； M： DNA ladder； R1 and R2： resistant varieties ROC1 and ROC9 that carrying Bru1；R3： model Bru1-containing variety R570； S1 and S2： susceptible varieties Co290 and Xuanzhe 3.

101份供試親本材料中， 共48份抗病材料含有Bru1標記（表 1）， 頻率為 47.5%， 表明中國甘蔗主要育種親本中褐銹病抗性主要由 Bru1控制； 其余 29份抗病材料和24份感病材料均不含Bru1標記（表1）， 顯示中國甘蔗主要育種親本中抗褐銹病基因除了 Bru1， 可能還有其他基因存在。

表1　甘蔗主要育種親本褐銹病抗性及Bru1基因的PCR檢測結果Table 1 Brown rust resistance and PCR detection of Bru1 in main sugarcane ancestral species

（續表1）

（續表1）

3　討論

明確中國甘蔗主要育種親本對銹病的抗性水平， 了解抗褐銹病基因在中國甘蔗主要育種親本中的分布狀況，不僅有利于評價和篩選抗性親本和科學選配， 還能提高抗褐銹病育種的效率， 對選育抗病品種、有效防控甘蔗病害具有重要意義。本研究明確了各親本對黑頂柄銹菌的抗性水平， 掌握了Bru1基因在這些親本中的分布狀況， 檢測篩選到含有抗褐銹病基因Bru1的親本材料48份， 為深入開展甘蔗抗褐銹病育種， 選育和推廣優良抗病品種， 有效防控甘蔗褐銹病提供了優良抗性親本、積累了基礎資料。

云南是中國甘蔗野生資源重要的分布中心和世界野生甘蔗起源中心之一， 其復雜多樣的地理及氣候條件形成了豐富的甘蔗種質資源， 是中國乃至世界甘蔗遺傳改良的天然珍貴基因庫之一［23-24］。與本課題組前期研究結果［21］一致， 本研究結果顯示中國國家甘蔗種質資源圃保存的主要育種親本中也蘊藏著優良的抗褐銹病基因 Bru1， 能夠提供豐富的甘蔗褐銹病的抗性親本， 作為選育抗褐銹病甘蔗品種很有利用前景的抗源種質。Glynn等［25］對485個親本和1072個雜交后代材料檢測顯示， Bru1是佛羅里達甘蔗遺傳基礎中褐銹病抗性的主要來源， 這與本研究的結論也是相同的。Racedo等［26］研究揭示 EEAOC常用親本材料和種質資源中除 Bru1外， 還存在甘蔗褐銹病潛在替代抗性來源， 這一發現對擴大甘蔗褐銹病抗性狹窄的遺傳基礎有幫助。相應地， 本研究中也有 29份抗褐銹病育種親本未被檢測到抗褐銹病基因 Bru1， 與我們前期研究有 20份抗褐銹病野生核心種質資源（多為割手密）［21］未被檢測到抗褐銹病基因 Bru1的結果一致， 暗示除了Bru1外， 可能還有其他抗褐銹病基因存在， 有待于進一步深入研究發掘， 從而克服抗源單一， 選擇性增加其他類型抗病基因在抗病育種中的引入與利用， 避免由銹菌致病性變異引起Bru1抗性喪失的潛在威脅。

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Identification of Resistance to Brown Rust and Molecular Detection of Bru1 Gene in 101 Main Sugarcane Breeding Parents in China

LI Wen-Feng， WANG Xiao-Yan， HUANG Ying-Fun*， ZHANG Rong-Yue， SHAN Hong-Li， LUO Zhi-Ming，and YIN Jiong

Sugarcane Research Institute， Yunnan Province Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Kaiyuan 661699， China

Sugarcane brown rust induced by Puccinia melanocephala is an important global disease. Bru1 is a major brown rust resistance gene with a broad-spectrum resistance against various brown rust pathogens originating from different countries. In order to assess the resistance level of main sugarcane breeding parents to Puccinia melanocephala， and determine the distribution of the Bru1 gene in these breeding parents in China， 101 main sugarcane breeding parents collected from the Chinese National Nursery of Sugarcane Germplasm Resources were evaluated and identified for their brown rust resistance at the seedling stage and for the presence of the brown rust resistance gene Bru1. Bru1 was detected to present in 48 （47.5%） resistant materials out of the 101 tested parental lines， indicating that brown rust resistance in main sugarcane breeding parents in China is primarily controlled by Bru1. The absence of Bru1 in the other 29 resistant and 24 susceptible parental lines suggests that they may carry brown rust resistance-associated genes other than Bru1. These results may facilitate future efforts to breed varieties with improved resistance to brown rust and may provide resistant parental lines for selecting and planting elite resistant varieties to effectively control brown rust disease in sugarcane.

Sugarcane； Main breeding parents； Brown rust resistance gene Bru1； Molecular detection

10.3724/SP.J.1006.2016.01411

本研究由國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-20-2-2）和云南省現代農業產業技術體系建設專項資助。

This study was supported by China Agriculture Research System （CARS-20-2-2） and the Agriculture Research System of Yunnan Province.*

（Corresponding author）： 黃應昆， E-mail： huangyk64@163.com， Tel： 0873-7227017

聯系方式： E-mail： ynlwf@163.com， 0873-7227004

Received（）： 2016-03-17； Accepted（接受日期）： 2016-06-20； Published online（網絡出版日期）： 2016-06-29.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160629.0822.004.html