“一鍋法”合成PCL-b-PEG嵌段聚合物及其自組裝行為

李彩今，胡　齊，李玉祥，李亞鵬，王靜媛

(吉林大學化學學院，無機合成與制備化學國家重點實驗室，吉林 長春 130023)

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“一鍋法”合成PCL-b-PEG嵌段聚合物及其自組裝行為

李彩今，胡齊，李玉祥，李亞鵬，王靜媛

(吉林大學化學學院，無機合成與制備化學國家重點實驗室，吉林 長春 130023)

利用點擊化學與酶促開環聚合相結合的“一鍋法”制備聚己內酯-b-聚乙二醇(PCL-b-PEG)兩親性嵌段聚合物.首先通過對二氯代乙氧基乙醇進行疊氮化親核取代修飾得到了同時引發點擊化學反應與酶促開環聚合反應的雙官能引發劑;再利用戊炔酸對聚乙二醇炔基化修飾;最后由雙官能引發劑的疊氮端基引發炔基化PEG的點擊化學，同時在生物催化劑Novozyme-435的催化下利用其羥端基引發己內酯的酶促開環聚合.經核磁共振與GPC的測試對所制備嵌段聚合物結構進行了表征并驗證了一鍋法合成的可行性.由GPC測試得到相對分子質量為15 093、多分散性良好(1.18)的嵌段聚合物.經過動態光散射測試得到水粒半徑為202 nm，而由透射電子顯微鏡測試所得的干燥狀態下粒子半徑為146 nm.

酶促開環聚合；點擊化學； 一鍋法

點擊化學作為一種新型的聚合方法自諾貝爾化學獎得主K.B.Sharpless提出以來備受關注[1].它被公認是一種反應方式簡單、快速高效、選擇性強、產率高的合成方法.因此越來越被廣泛地應用于合成領域.而關于己內酯的酶促開環聚合因其所具有的無毒、高效、可回收、立構選擇性等諸多優點被不斷地研究，其中以其與不同聚合方法結合制備特殊結構聚合物為重點[2-6].Andreas Heise 小組先后利用不同聚合方法合成了一系列嵌段聚合物[7].S.M.Howdle和Holger Frey 等分別在超臨界CO2環境下利用化學酶方法一鍋合成雙嵌段聚合物和接枝聚合物[8-11].近年來關于對點擊化學與開環聚合及原子轉移自由基聚合反應(ATRP)相結合制備特殊結構聚合物的研究不斷被報道，而對于點擊化學與開環聚合反應的同時“一鍋法”研究卻較少[12-13].本文通過雙官能引發劑將點擊化學與酶促開環聚合反應進行“一鍋法”同時聚合制備了PCL-b-PEG兩親性嵌段聚合物，并對其自組裝行為進行了研究與表征.PEG由于其自身的穩定性、生物相容性、水溶性、無毒及快速降解的性質被廣泛地應用于材料科學與生物技術研究，而疏水聚合物通過鏈接PEG鏈段可使其經自組裝行為轉變成核殼結構膠束，利用該膠束的包覆可在人體循環中防止蛋白質與生物酶的吸附并增加其保留時間.這種聚合物膠束作為基因與藥物載體方面有著重要作用.PCL作為一種脂質聚酯由于其良好的生物降解性、生物相容性及無毒性被廣泛地應用于生物材料.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

試劑：己內酯(ε-CL，Aldrich公司)；聚乙二醇(PEG相對分子質量為2 000，Aldrich公司)；4-戊炔酸、 2-氯乙氧基乙醇(Aldrich公司)；固定化酶Novozyme435(諾維信公司提供)；硫酸鎂、中性氧化鋁、2，2-聯吡啶(bpy)(上海試劑一廠)；疊氮化鈉(Fluka)；4-二甲氨基吡啶(DMAP，Fluka)；乙酸乙酯、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醚、二氯甲烷、二甲基亞砜(DMSO)、氯化亞銅、四氫呋喃(THF)(北京化學試劑廠).

儀器：核磁共振(NMR)BrukerARX-500；傅里葉變換紅外光譜分析儀(FTIR)Bruker IFS66V；GPC測試(Waters410)；Zeta 電位分析儀(Brookhaven Instruments Corporation)；透射電子顯微鏡(JEOL JEM 2010)；熒光分析儀(Obin YvonSpex Fluorolog 3).

1.2雙官能引發劑的制備方法

在100 mL圓底反應瓶中加入2-氯乙氧基乙醇(4 mL，32 mmol)和大過量的疊氮化鈉(20 g，160 mmol)，以去離子水(60 mL)為溶劑，在加熱攪拌、回流條件下進行親核取代反應48 h，待反應瓶冷卻后，反應溶液用乙酸乙酯萃取，經去離子水洗脫殘余疊氮化鈉，用無水MgSO4干燥，然后減壓蒸除有機溶劑相.

1.3PEG-2000的炔基化處理

將0.6 g 4-戊炔酸(0.006 mol)溶解于DMSO(20 mL)中，在加入0.244 4 g DMAP(0.002 mol)后磁力攪拌活化1 h.在攪拌條件下將10 g PEG(0.005 mol)溶于DMSO(20 mL)中制得PEG溶液，然后將該溶液加入到經活化后的戊炔酸溶液中，在40℃條件下攪拌反應24 h.產物先由無水乙醚沉淀初步提取，粗產物用二氯甲烷再溶解，用1 mol/L鹽酸與去離子水各洗3次，用無水MgSO4干燥并過濾，再經減壓蒸除有機溶劑相后放入到真空烘箱干燥至恒重.

1.4“一鍋法”合成PCL-b-PEG

將用真空干燥24 h的Novozyme435固定化酶(0.108 g)加入到由真空處理的氬氣保護的圓底反應瓶中，依次加入0.556 g炔基化PEG與0.04 g聯二吡啶，通過反復抽放氣體3次，對反應瓶進行無氧處理.將4 mL己內酯、1 mL DMF溶劑、30 μL疊氮引發劑加入到反應體系中，在60℃條件下攪拌反應6 h.粗產物經過中性Al2O3處理提純后減壓除去有機溶劑，將濃縮溶液在乙醚中沉淀，再經乙醚反復洗滌后置于真空烘箱中干燥48 h.干燥產物經四氫呋喃溶解后，裝入透析帶中，在去離子水中透析除去未反應的炔基化PEG.減壓蒸除有機溶劑后真空干燥至恒重.合成PCL-b-PEG的過程見圖1.

圖1　合成嵌段共聚物 PCL-b-PEG的過程

1.5PCL-PEG產物在水溶液中的自組裝行為

將1 mg聚合產物PCL-b-PEG溶解于1 mL四氫呋喃(THF)中，并在超聲溶解條件下緩慢滴入20 mL 蒸餾水，出現淡藍色乳光，室溫下繼續超聲1 h，然后對膠束溶液直接進行DLS測試.取膠束溶液滴于潔凈銅網上，干燥后進行TEM測試.

1.6PCL-b-PEG產物臨界膠束樣品的制備

以上述聚合物膠束水溶液為基礎稀釋并從5×10-2～5×10-7mg/mL的聚合物溶膠束水溶液獲得所需濃度，待用.芘溶液的配制的方法：首先稱量一定量的芘，將其溶解于丙酮溶液中，在室溫下通過超聲使芘完全溶解，得到濃度為4.75×10-5mol/L的芘溶液.分別量取20 μL芘溶液移至9個10 mL的容量瓶中，室溫下靜置至丙酮完全揮發.然后將配制好的不同濃度的聚合物膠束溶液分別加入到含有芘的9個容量瓶中，定容至10 mL，室溫下超聲0.5 h使芘能夠完全溶解到聚合物膠束水溶液中，室溫下放置24 h，待測.測量原則：以發射波長測得最大激發波長，以激發波長測得最大發射波長；用熒光分析儀(obin YvonSpex Fluorolog 3)測試不同濃度含芘的聚合物膠束的熒光發射光譜，激發波長為 335 nm，狹縫寬度為 5 nm.

2　結果與討論

2.1雙官能引發劑的合成

含有端羥基的小分子引發劑被大量的用于引發酶促開環聚合，而對鹵代分子的親核取代是對引發劑修飾的一種簡單而且有效的手段[14-16].因此本文采用對2-氯乙氧基乙醇進行疊氮化鈉的親核取代修飾來制備雙官能度的引發劑.修飾后產物的核磁譜圖見圖2.由圖2a可見50.19(N3—CH2—)、69.15(N3—CH2—CH2—)、72.63(—O—CH2—CH2—OH)和60.39(—CH2—OH)4個明顯的特征峰，這4個吸收峰相對于反應物特征峰位置均發生偏移，證明了修飾的引發劑成功發生[17].

圖2　引發劑分子的13C NMR(a)及嵌段聚合物PCL-b-PEG的1H NMR(b)

2.2PEG的炔基化修飾

由于成酯反應是一種常見而且被廣泛使用的端基修飾方法[18]，因此本文通過4-戊炔酸與PEG鏈段端羥基的酯化反應對PEG成功進行了炔基化修飾(見圖3)，從圖3b中可觀察到PEG原有特征峰，并且在3 290 cm-1處出現炔基特征吸收峰，證明對PEG炔基化的修飾成功.由于戊炔酸為過量，因此可保證對PEG端羥基修飾得完全.

2.3“一鍋法”合成的PCL-b-PEG產物分析

利用所合成的雙官能引發劑引發己內酯與炔基化PEG的“一鍋法”聚合反應，從反應產物的核磁共振譜圖2(b)可以看出，PCL鏈段中特征峰(a-c)的出現，證明了引發劑對己內酯的酶促開環聚合反應成功引發，而由PEG鏈段的特征峰(k，k′，p)與2個點擊反應特征峰(g與h)的出現則證明了引發劑對炔基化PEG點擊化學反應的引發作用.紅外光譜表征見圖3.圖3(a)產物的紅外光譜圖中炔基與疊氮基特征吸收峰的消失則進一步證明酶促開環聚合與點擊化學反應的同時進行.通過對聚合產物的GPC測試得到對稱單峰曲線見圖 4，相對分子質量及多分散性分別為15 093與1.18.因此由NMR及GPC分析可證明引發劑同時引發了2種聚合反應并且得到分散性良好的嵌段聚合產物.

圖3　引發劑分子(a)、炔基PEG(b)和PCL-b-PEG的紅外光譜(c)

圖4　嵌段聚合物PCL-b-PEG(a)及炔基PEG凝膠滲透(b)的色譜

2.4聚合物的自組裝行為分析

兩親性嵌段聚合物由于其不同嵌段之間的不相容性，因此在水溶液中疏水鏈段會驅動聚合物鏈形成球狀膠束聚集體，這種膠束聚集體由疏水的PCL鏈段組成內核，而親水的PEG鏈段以溶劑化形式在核周圍形成保護殼來維持膠束的穩定.對聚合物自組裝行為表征的DLS與TEM測試圖見圖5，通過TEM測試可觀察聚合物膠束的形貌，從圖5(b)中可以觀察到該納米粒子呈均勻的球形，膠束粒徑約為146 nm[19-20].TEM的測量值則明顯小于DLS的測量值(202 nm)，這是由于DLS的測試條件是在溶液狀態下，此時聚合物膠束處于溶脹狀態，也就意味著聚合物的親水鏈段在水溶液中處于伸展的狀態，而TEM測試的則是干燥狀態下的膠束粒徑，因此導致測定值小于DLS得到的粒徑.

圖5　嵌段聚合物PCL-b-PEG的DLS(a)及TEM(b)

2.5兩親性嵌段聚合物的臨界膠束濃度測定

自從1977年Kalyanasundaram等人研究發現芘的熒光發射光譜對溶劑極性的敏感性后，芘就被廣泛用做研究水中疏水微區形成的靈敏而有效的熒光探針.它的熒光強度會隨著其周圍環境極性的變化而變化，因此可以測試溶劑的環境.在芘的熒光光譜中有16個峰，用I代表峰的強度，則第1峰和第3峰強度之比(I1/I3)可用來判斷所檢測到的環境極性是否發生變化.當溶液中聚合物濃度過低而無法形成膠束時芘的I1/I3值與其在水溶液中的I1/I3值相同.而當聚合物的濃度達到可以形成膠束的濃度并形成膠束時，較強的疏水性會富集于疏水內核.由于芘的環境極性發生改變，它的I1/I3值也急劇變化.因此可用芘為熒光探針來測定聚合物初始形成膠束時的濃度值，即臨界膠束濃度(CMC).將含芘兩親性嵌段共聚物膠束溶液熒光測試的I1/I3值與膠束濃度lgc作圖，所得結果見圖6.從圖6(b)中切線交點可得出聚合物CMC為0.002 3 mg/mL[21].

圖6　不同濃度嵌段聚合物PCL-b-PEG水相中熒光光譜(a)及不同濃度PCL-b-PEG熒光光譜I1/I3的比值分析(b)

3　結論

通過將酶促開環與點擊化學反應相結合的“一鍋法”合成PCL-b-PEG兩親性嵌段聚合物，并對聚合物在水溶液中的自組裝行為進行了研究.利用雙官能引發劑對2種不同反應進行同時引發聚合，利用核磁表征證明了產物的結構，GPC測試則證明得到了相對分子質量為15 093、多分散性為1.18的目標聚合產物.通過DLS與TEM測試對其自組裝行為進行了研究，得到膠束在溶液與干燥條件下的直徑分別為202與146 nm.由于PCL與PEG均具有良好的生物相容性和可降解性使產物具有很好的醫藥應用前景，同時本文的“一鍋法”合成具有反應簡單可控的優點外還克服了多步反應繁瑣與提純困難的缺點，因此其潛在應用價值有待于進一步研究與探索.

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(責任編輯：石紹慶)

Synthesis of PCL-b-PEG block polymer by “one-pot” and its self-assembly behavior research

LI Cai-jin，HU Qi，LI Yu-xiang，LI Ya-peng，WANG Jing-yuan

(State Key Laboratory of Inorganic Synthesis & Preparative Chemistry，School of Chemistry，Jilin University，Changchun 130023，China)

Biodegradable and biocompatible PCL-b-PEG amphiphilic block copolymers were prepared by combination of Enzymatic ring-opening polymerization and “click” chemistry via “one-pot” method under mild conditions.First the bifunctional initiator was prepared by chlorinated ethoxy ehanol which was displaced by azide nucleophilic and additionaly the polyethyleneglycol was modified by utilized pentynoic acid.Ultimately，the bifunctional initiator initiated click chemistry and enzymatic ring-opening polymerization in the present of biocatalyst Novozyme-435.Click chemistry of the alkynylation PEG was initiated by azido-ended of the bifunctional initiator，simultaneously enzymaic ring-opening polymerization was triggered by the other hydroxyl-ended with the present of biocatalyst Novozyme-435.The composition and block architecture of the copolymers were characterized by1H NMR，FTIR and GPC analyses.These amphiphilic block copolymers could self-assemble into sphere-like aggregates in aqueous solution with diverse diameters.The size and shape of the block-copolymers micelles were investigated by using dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscope(TEM).The results of DLS and TEM indicate that the copolymers micelles appear a spherical shape and had a mean diameter (146 nm).

enzymatic ring-opening polymerization；click chemistry；onepot

1000-1832(2016)03-0104-06

2014-11-28

國家自然科學基金資助項目(20904014).

李彩今(1964—)，女，博士，講師，主要從事無機合成與制備研究；通訊作者：李亞鵬(1978—)，男，博士，教授，主要從事醫用高分子材料研究.

O 631[學科代碼]150·45

A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.03.020