響應面法優化酶解海洋低值魚肉制備抗氧化肽工藝

曾健輝，朱寶君，王 娟，孔繁茂，馬廣智，3*，黃儒強*

(1.華南師范大學生命科學學院，廣東廣州 510631；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510600；3.廣東科學技術職業學院，廣東珠海 519090)

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響應面法優化酶解海洋低值魚肉制備抗氧化肽工藝

曾健輝1，朱寶君1，王 娟2，孔繁茂1，馬廣智1，3*，黃儒強1*

(1.華南師范大學生命科學學院，廣東廣州 510631；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510600；3.廣東科學技術職業學院，廣東珠海 519090)

[目的]優化堿性蛋白酶制備海洋低值魚抗氧化肽的工藝。[方法]以DPPH自由基清除率為指標，在酶解溫度、pH、加酶量、底物濃度等條件下進行單因素試驗，在此基礎上運用響應面法優化堿性蛋白酶酶解低值魚肉制備抗氧化肽的工藝條件。[結果]在溫度54 ℃、pH 8.8、底物濃度200 g/L、加酶量2 500 U/g的條件下酶解3 h，得到抗氧化肽的DPPH自由基清除率理論值為62.66%，實際值為61.87%，相對誤差為1.26%。[結論]該研究為低值魚抗氧化肽的開發利用提供理論依據。

響應面法；酶解；低值魚；抗氧化肽

隨著我國經濟與科技的快速發展，水產品的產量及加工能力不斷提高，我國魚類加工業較20年前已取得了很大進步，但與發達國家水產品加工業相比，仍存在基礎研究薄弱、加工與綜合利用率低、附加值低等問題[1-3]。低值魚占海洋漁獲物的60%～70%，具有體型小、營養豐富、種類繁多及產量巨大的優點，但由于其極易腐爛、價格較低使得捕撈與存儲較為困難，再加上無有效的加工方法，造成生物資源的極大浪費[4-5]。提高低值魚的精深加工與綜合利用水平，對于我國經濟和社會發展都有重要意義。

生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物[6]。研究發現，生物活性肽比氨基酸更易吸收，具有抗高血壓[7]、抗氧化[8]等作用。人類健康在內生或者外生自由基和氧化應激作用下穩態會失調，使細胞、組織和DNA受到損傷[9]，同時自由基過多也會導致許多疾病如心血管疾病、癌癥等的發生[10]。目前許多合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚(BHA)、沒食子酸丙酯(PG)等已廣泛應用于食品保存或者抑制脂質過氧化[11]，但合成抗氧化劑也有一定的危害[12]。來源于天然食品的抗氧化肽逐漸被廣泛關注，目前研究者已從多種天然食品如鴨皮[13]、豆類[14]、扇貝[15]等中分離得到了抗氧化肽。筆者以海洋低值魚為原料，通過堿性蛋白酶解魚肉蛋白制備抗氧化肽，以DPPH自由基清除率為指標，利用響應面法設計優化低值魚蛋白的酶解工藝條件，探索低值魚的深加工途徑，提高資源利用率和經濟價值，為低值魚抗氧化肽的開發利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑海洋低值魚購自于市場，堿性蛋白酶(20萬U/g)購自于江蘇瑞陽生物有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自美國Sigma公司，其他化學試劑均為分析純。

1.2設備 電熱恒溫水浴鍋：HWS12，上海一恒儀器公司；pH計：PB-10型，賽多利斯科學儀器有限公司；冷凍干燥機：VirTis，美國SP公司；臺式高速冷凍離心機：CT15RT，天美科學儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器：85-2，上海思樂儀器廠；分析天平：BSA224S，賽多利斯科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計：UV-5100B，上海元析儀器有限公司；粉碎機：DT-10A，廣州市綠向生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程。其工藝流程：低值雜魚→清洗→取肉→勻漿→酶解→離心→上清液→冷凍干燥→成品分析。操作要求：①清洗勻漿。將新鮮的雜魚去掉頭、尾和內臟，清洗干凈，然后取肉絞碎成魚糜，按比例加入一定量的水，將魚糜打成漿狀。②酶解。將勻漿后的魚肉在漩渦振蕩器中混勻后置于恒溫水浴鍋中保溫15 min，調節pH，加入適量酶進行酶解，酶解結束后立即在沸水浴中加熱10 min滅酶，離心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，上清液冷凍干燥備用。

1.3.2DPPH清除率測定[16]。以95%乙醇溶液溶解DPPH，配成一定濃度溶液。吸取2 mL的酶解液，加入2 mL DPPH溶液，搖勻后，在室溫下放置30 min，以95%乙醇溶液調零，測定517 nm處的吸光值A1，同時測定2 mL酶解液與2 mL 95%乙醇混合溶液在517 nm處的吸光值A2，再測定2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水在517 nm處的吸光值A0，每組試驗重復3次。

1.3.3單因素試驗。在前期研究基礎上，選用堿性蛋白酶對低值魚肉進行酶解，以DPPH自由基清除率為指標研究加酶量(U/g)、酶解時間(h)、pH、酶解溫度(℃)和底物濃度(g/L)5個單因素對酶解的影響。

1.3.4響應面試驗。在單因素試驗的基礎上，在一定酶解時間(3 h)下，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，進行4因素3水平的響應面分析試驗，以加酶量(A)、pH(B)、溫度(C)和底物濃度(D)4個因素為自變量，以DPPH自由基清除率為響應值，利用Design Expert 8.0.5b軟件進行數據擬合，確定各因素對酶解物DPPH自由基清除率影響的顯著性和各條件的最佳組合。編碼水平見表1。

表1　響應面試驗的因素和水平

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1時間對酶解的影響。由圖1可知，隨著時間的延長，酶解物的DPPH自由基清除率逐漸增大，當酶解時間超過3 h后DPPH自由基清除率逐漸下降，反應初期酶和底物濃度較大，反應速度快，當超過3 h后,由于底物被消耗，同時酶解產物對反應有一定的影響，DPPH自由基清除率上升緩慢，因此，選擇酶解時間為3 h。

圖1　時間對酶解的影響Fig.1　The influence of time to enzymatic hydrolysis

2.1.2底物濃度對酶解的影響。由圖2可知，隨著底物濃度的增大，酶解物的DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趨勢，在底物濃度為100～200 g/L時，酶解物的DPPH自由基清除率隨底物濃度的增大而增大，底物濃度為200 g/L時達到最高，當底物濃度繼續增大時，反應速率變化較小，因此，選擇底物濃度為200 g/L。

圖2　底物濃度對酶解的影響Fig.2　The influence of substrate concentration to enzymatic hydrolysis

2.1.3溫度對酶解的影響。由圖3可知，酶解物的DPPH自由基清除率隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，在40～55 ℃，DPPH自由基清除率隨著溫度的升高而增大，55 ℃時達到最大，當溫度高于55 ℃時，DPPH自由基清除率開始下降，這是因為酶有適宜的溫度范圍，溫度過高會影響酶的活性，因此，選擇酶解溫度55 ℃。

圖3　溫度對酶解的影響Fig.3　The influence of temperature to enzymatic hydrolysis

圖4　pH對酶解的影響Fig.4　The influence of pH to enzymatic hydrolysis

2.1.4pH對酶解的影響。由圖4可知，酶解物的DPPH自由基清除率隨pH的升高呈先上升后下降的趨勢。在pH 7～9時，DPPH自由基清除率隨pH增大而增大。當pH為9時，DPPH自由基清除率達到最大。當pH超過9時，DPPH自由基清除率開始下降，酶解pH會影響酶的活性，過酸或者過堿都不利于反應的進行，因此，選擇pH為9。

2.1.5加酶量對酶解的影響。由圖5可知，隨著加酶量的增大，酶解物的DPPH清除率呈先上升后穩定的趨勢。在加酶量1 500～2 500 U/g時，DPPH自由基清除率逐漸增大，當加酶量大于2 500 U/g時，DPPH自由基清除率基本保持不變，為了節約成本選擇加酶量2 500 U/g。

圖5　加酶量對酶解的影響Fig.5　The influence of enzyme dose to enzymatic hydrolysis

2.2響應面法優化酶解海洋低值魚肉制備抗氧化肽的工藝

2.2.1二次響應面回歸模型的建立。選用中心復合模型，設計4因素3水平共29個試驗點，其中24個析因點，5個中心點。響應面試驗結果見表2。

表2　響應面試驗結果

接下表

續表2

對響應面結果進行多元回歸擬合，得到相應回歸方程：DPPH自由基清除率 =62.55+0.088A-0.66B-0.76C+0.041D-0.53AB+0.057AC-1.27AD+4.16BC+0.22BD+0.26CD-8.17A2-4.07B2-4.46C2-7.61×D2，用 Design Expert8.0.5b軟件對表2中的數據進行多元回歸分析，回歸統計分析結果表明，以DPPH自由基清除率為響應值時，回歸方程擬合檢測P<0.000 1，差異極顯著，同時失擬項P=0.652 2>0.05，差異不顯著，說明未知因素對試驗干擾很小，模型擬合度較好，同時回歸方程相關系數R2=0.994 2，說明響應值的變化有99.42%來源于所選變量。這說明試驗方法可靠，能較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。各因素對DPPH自由基清除率的影響程度由大到小依次為C(溫度)、B(pH)、A(加酶量)、D(底物濃度)，方差分析結果表明，AD、BC之間交互作用極顯著，二次項A2、B2、C2、D2均極顯著(P<0.001)，表明各考察因素對酶解工藝參數的影響具有交互作用，而不是簡單的線性關系。

2.2.2各因子交互作用的影響。圖6是根據回歸方程所繪制的響應面圖，其中，各圖表示A、B、C、D中任意2個變量取零水平時，其余2個變量對DPPH自由基清除率的交互影響，它們能直觀地描述2個因素對響應值的交互影響。由圖6可知，響應值隨著加酶量、底物濃度、溫度和pH的增大呈先增后降的趨勢，說明這4個因素在所選范圍內能產生最佳的響應值。

圖6　各因子交互作用對抗氧化肽DPPH清除率的響應曲面Fig.6　The response surface of the influence of each factor interaction to DPPH scavenging rate

2.2.3驗證試驗。響應面分析得到的優化條件：加酶量2 505.13 U/g，溫度54.19 ℃，底物濃度199.8 g/L，pH 8.84，根據實際情況調整參數為加酶量2 500 U/g，溫度54 ℃，底物濃度200 g/L，pH 8.8進行驗證試驗，重復3次得到DPPH的自由基清除率為61.87%，相對誤差為1.26%。

3　結論

該試驗以DPPH自由基清除率為指標，在單因素試驗的基礎上進行響應面試驗，利用響應面法得到了加酶量、溫度、底物濃度和pH對DPPH自由基清除率的影響。各因素對DPPH自由基清除率的影響由大到小依次為溫度、pH、加酶量、底物濃度，通過響應面分析得到低值魚制備抗氧化肽的酶解條件：加酶量2 500 U/g，溫度54 ℃，底物濃度200 g/L，pH 8.8，在此條件下，DPPH的自由基清除率為61.87%。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Antioxidant Peptides from Low Value Fish by Response Surface Methodology

ZENG Jian-hui1, ZHU Bao-jun1, WANG Juan2, MA Guang-zhi1,3*, HUANG Ru-qiang1*et al

(1. School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510631; 2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou, Guangdong 510600; 3.Guangdong Institute of Science and Technology, Zhuhai, Guangdong 519090)

[Objective] Optimization of antioxidant peptides from marine low value fish by alkaline protease was studied. [Method] The enzymatic hydrolysis conditions for the preparation of antioxidant peptides were optimized using the response surface methodology based on single factor experiments, including hydrolysis temperature, hydrolysis pH, enzyme dose and substrate concentration. [Result] The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows: substrate concentration 200 g/L, enzyme dose 2 500 U/g, pH 8.8, hydrolysis temperature 54 ℃ for 3 h, under these conditions the theoretical value of DPPH free radical scavenging rate was 62.66%, the actual value was 61.87%, the relative error was 1.26%. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for development and utilization of antioxidant peptide of low value fish.

Response surface methodology; Enzymatic hydrolysis; Low value fish; Antioxidant peptides

廣東省產學研項目(2013B090600153)；廣東省科技計劃項目(2013B020312004)；廣東省海洋漁業科技推廣專項科技攻關項目(A201301C10)。

曾健輝(1989- )，女，山西大同人，碩士研究生，研究方向：天然產物的提取與分離。*通訊作者，馬廣智，教授，博士，博士生導師，從事水生動物毒理學方面的研究。*通訊作者，黃儒強，教授級高級工程師，博士，碩士生導師，從事天然產物分離方面的研究。

2016-06-17

S 985.1

A

0517-6611(2016)22-080-04