大豆疫霉病拮抗內生真菌的鑒定與篩選

劉永政，邊 爽，孫立杰，宋佳宇，董 慧，張玉琦，趙靜博，肖佳雷

(東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

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大豆疫霉病拮抗內生真菌的鑒定與篩選

劉永政，邊 爽，孫立杰，宋佳宇，董 慧，張玉琦，趙靜博，肖佳雷*

(東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

[目的]篩選出拮抗致病大豆疫霉的真菌菌株，為深入研發(fā)生物菌劑提供依據。[方法]采用平板對峙法測定40 株野生大豆真菌對疫霉菌的抑制作用。[結果]供試的40 株菌株，不同菌株間菌落型態(tài)差異較大。從光滑程度分析，36份菌落表面不光滑，3份表面光滑并顯淺黃色；從菌落顏色分析，正面以白色為主，其次是黃色和粉色；反面則以紫色為主，其次為黑色和綠色；從菌落生長型態(tài)分析，大多數菌落呈白色絮狀突起或羊毛狀菌絲；11株野生大豆內生真菌的抑菌率變化幅度為62%～81%，80%以上共1株Y4-S(Ⅰ)，75%～80%共2株，70%～75%共3株，其余5株均低于70%。抑菌率從大到小依次為Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1。 [結論]最強拮抗菌株Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1顯微型態(tài)相似，呈枝狀，有隔，初步判斷可能來源同一屬，具體屬種需要進一步判斷。

大豆疫霉病；野生大豆；內生真菌；拮抗菌株

大豆疫霉根腐病是嚴重影響世界大豆生產的毀滅性病害之一[1-2]。該病害危害面積大，毀滅性強，每年使大豆減產10%左右，且嚴重降低大豆的品質[3]。目前，由于大豆疫霉具有很高的小種變異性，單一抗性品種的有效期短，對大豆疫霉根腐病的危害不能達到較高的防治效果；化學防治殺菌劑不能對所有的小種有效，農藥殘留大、污染環(huán)境；各種栽培措施雖可減輕損失但不能完全控制該病害[4]。采用微生物菌劑，研發(fā)生物農藥的生物防治則是目前解決大豆疫霉病的重要措施。野生大豆內生真菌相對于栽培大豆附生內生真菌具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，具有豐富的抗逆資源，因此，把拮抗性野生大豆內生真菌作為生防菌及外源基因載體更易于發(fā)揮作用，創(chuàng)造出新的可利資源[5-6]。鑒于此，筆者選用原生境野生大豆中分離的40株內生真菌，采用平板對峙法進行了大豆疫霉病的拮抗內生真菌菌株鑒定與篩選，以期為研發(fā)生物菌劑提供重要的內生真菌資源。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。 大豆疫霉病菌為生理1號小種，由東北農業(yè)大學大豆研究所提供；野生大豆內生真菌40株，由東北農業(yè)大學生命科學學院植物生物工程研究室提供，主要分布黑龍江省不同區(qū)、市及縣，菌株名稱及來源見表1。

1.1.2培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。將土豆去皮切成小塊，用蒸餾水煮沸30 min，經紗布過濾，收集濾液，將稱量好的蔗糖加入，用攪拌器攪拌均勻，加入定量的稀釋好的含有蔗糖的土豆汁，121 ℃、0.1 kPa滅菌20 min。

加富 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯塊 200 g，葡萄糖 10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1菌株活化。將得到的內生真菌接種到PDA平板培養(yǎng)基上，于26 ℃下培養(yǎng)，24 h后開始不斷觀察直到有明顯的菌落形態(tài)，及時進行照片記錄和菌落形態(tài)描述(包括菌落顏色、菌絲形態(tài)等一系列特征)。真菌菌落外觀形態(tài)特征采集采用日本佳能 60D相機(18～200 mm IS)，技術參數為：APS-C規(guī)格數碼單反，1 800萬有效像素，10倍光學變焦。

1.2.2對峙試驗。采用平板對峙法檢測野生大豆內生真菌對病原真菌的拮抗效果。第1步，篩選對病原真菌有拮抗作用的菌株，挑取內生真菌菌絲接種于平板中央，然后將4種不同的致病真菌接種于四周，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。觀察有無拮抗作用。第2步，檢測具有拮抗作用的內生真菌對病原真菌作用的強弱，挑取病原真菌接種于中央，內生真菌接種于兩側，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后測量抑菌圈大小[7]。

表1　野生大豆內生真菌名稱及來源

1.2.3指標測定。

1.2.3.1抑菌圈直徑。在對峙法中形成明顯抑菌現(xiàn)象后，測量兩菌落中心連線上病原菌的菌落直徑，求各重復的平均值，以此評價拮抗菌對各個被測菌的抑菌效果。

1.2.3.2拮抗菌株直徑。垂直于大豆內生真菌中心連線上的病原菌落直徑，求各重復的平均值，以此作為對照病原菌的菌落直徑。

1.2.3.3抑菌率。拮抗真菌對于病原菌的拮抗程度。抑菌率=(對照病原菌的菌落直徑-處理病原菌的菌落直徑) /對照病原菌的菌落直徑[8]。

1.2.4顯微觀察。 將挑選出的具有拮抗效果的內生真菌進行繼代培養(yǎng)。接種活化的對應內生真菌到PDA平板上，26 ℃下培養(yǎng)3～4 d，將滅過菌的載玻片斜插入到已活化菌株平板的培養(yǎng)基上，26 ℃下培養(yǎng)48 h，讓菌絲自然爬到載玻片上后取出載玻片進行顯微觀察。應用正立生物顯微鏡Axioskop 2 plus FL(德國蔡司公司)，在40倍放大倍數下觀察菌絲形態(tài)。

2　結果與分析

2.1不同內生真菌菌落特征表2統(tǒng)計分析表明，不同菌株間菌落型態(tài)差異較大。從光滑程度分析，40份材料中有36份菌落表面不光滑，3份表面光滑并顯淺黃色，1份污染；從菌落顏色分析，正面以白色為主，其次為黃、粉色；反面則以紫色為主，其次為黑、綠色；從菌落生長型態(tài)分析，大多數菌落呈白色絮狀突起或羊毛狀菌絲。菌株Y2-L(Ⅲ)和y6s-8表面分泌淺黃色蠟狀物質，疑是油，具體成分待定。

表2　不同菌株菌落型態(tài)特征統(tǒng)計

接下表

續(xù)表2

2.2大豆疫霉病拮抗內生真菌菌株鑒定與篩選將40株已活化的內生真菌分別接種了單對排布的對峙培養(yǎng)基，共有11種表現(xiàn)出了對大豆疫霉的拮抗作用。表3表明，11株野生大豆內生真菌的抑菌率變化幅度為62%～81%，80%以上共1株Y4-S(Ⅰ)，75%～80%共2株，70%～75%共3株，其余5株均低于70%。抑菌率從大到小依次為Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1。從來源地分析，牡丹江寧安縣野生大豆內生真菌具有拮抗功能的菌株較多，其次為同江市和遜克縣，進一步表明黑龍江省大豆主產區(qū)的野生大豆具有較好的抗大豆疫霉病作用。

2.3拮抗菌株的菌落特征及顯微觀察圖1表明，3株具有拮抗作用野生大豆內生真菌不僅來源地不同，而且來自于野生大豆的不同器官。Y4-S(Ⅰ)菌株分離器官為葉片，菌落正面不光滑，為淺紫色絨毛狀，反面中央為深紫色，向周圍放射性生長，顏色逐漸變淺；Y5-r(Ⅱ)-1菌株分離器官根，表面不光滑，菌絲為棉花狀，正面為白色，反面為乳白色；Y6R-15-1分離器官莖，表面不光滑，有白色針狀突起，正面為白色，反面為紫紅色，培養(yǎng)基為紫色。顯微結構分析，3株拮抗內生真菌的型態(tài)相似，呈枝狀、有隔，初步判斷可能來源統(tǒng)一屬，具體屬種需要進一步判斷。

表3　拮抗菌株的相關測量數據

圖1　拮抗菌株型態(tài)和顯微結構特征(40×)Fig.1　Morphology and microstructure of antagonistic strains(40×)

3　結論

從不同地區(qū)采集野生大豆根、莖、葉器官，分離獲得內生真菌，對大豆疫霉病進行拮抗篩選，篩選出拮抗菌11株，即Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1，菌株間菌落生長型態(tài)差異較大，而菌株的顯微結構極為相似，可能屬于同一種屬。這些拮抗真菌具有遺傳多樣性，為大豆生產中病害的生物防治提供了新的菌種來源。

[1] 馬淑梅，邵紅濤，韓新華.黑龍江大豆栽培品種和新品系對疫霉病抗性評價及抗病基因分析[J].中國農學通報，2013，29(30)：191-196.

[2] 王偉威，魏崍，丁俊杰，等.大豆品種(系)對不同疫霉菌生理小種的抗性研究[J].大豆科學，2014，33(4)：559-562.

[3] 徐鵬飛，姜良宇，李文濱，等．黑龍江省大豆品種對大豆疫霉根腐病抗性評價及抗性基因推導[J]．中國油料作物學報，2011，33(5)：521-526．

[4] 王光華，周克琴，張秋英，等.拮抗細菌BRF-1對幾種植物病原真菌的抗生效果[J].中國生物防治，2003，19(2)：73-77.

[5] 張淑珍，徐鵬飛，靳立梅，等． 野生大豆對大豆疫霉根腐病抗感反應及聚類分析[J]．東北農業(yè)大學學報，2009，40(11)：1-6．

[6] 李麗艷，蔣繼志，郭文.致病疫霉拮抗細菌的篩選及抑菌作用研究[J].安徽農業(yè)科學，2011，39(24)：14671-14675.

[7] 高同國，李術娜，張冬冬，等.大豆根腐病生防細菌優(yōu)勢菌株的篩選、鑒定及生防效果驗證[J].大豆科學，2015，34(4)：661-665.

[8] 謝晶.植物病原菌拮抗微生物的篩選、鑒定及拮抗機理研究[D].成都：四川大學，2004.

Identification and Screening of Endophytic Fungi againstPhytophthorasojae

LIU Yong-zheng, BIAN Shuang, SUN Li-jie, XIAO Jia-lei*et al

(College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

[Objective] Screening of antagonistic phytophthora pathogenic fungal strains provide the basis for further research and development of biological agents. [Method] Forty strains of fungus were tested. The inhibitory effect of wild soybean fungi on the wild soybean was determined by the method of plate confrontation. [Result] Among the tested 40 strains colony morphology are quite different from each other. On the analysis of smoothness, there are thirty-six colonies whose surface is not smooth, while three colonies appear smooth and pale yellow; On the analysis of colony colors, the front side is mainly white, followed by yellow and pink while, and the back side is mainly purple, followed by black and green; On the analysis of colony growth pattern, most of the colonies appear white flocculent protrusions or wool like hyphae.The inhibitory rates of 11 strains of wild soybean endophytic fungus are 62%-81%, with one strain of Y4-S (I)more than 80%, two strains in 75%-80%, three strains in 70%-75%, and the remaining five strains are less than 70%.Inhibition rate in descending order is Y4-S(Ⅰ), Y5-r(Ⅱ)-1,Y6R-15-1,Y1-r-3,Y5R4, Y6S-26, Y5LB, Y5r-12, Y2-5(Ⅱ),Y2-S,Y5R18-2-1. [Conclusion] The strongest antagonistic effect of strains are Y4-S (Ⅰ), Y5-r(Ⅱ)-1 and Y6R-15-1.They have similar microscopic form as dendritic, and they have separated. After a preliminary judgment, they may be a genus of unity, but their specific species require further judgment.

Phytophthorasojae; Wild soybean; Endophytic fungi; Antagonistic strains

黑龍江省自然基金項目(C2015008)；黑龍江省哈爾濱市人才專項(2015RQQXJ019)；國家青年基金項目(31101171)；東北農業(yè)大學創(chuàng)新項目SPIT(201610224154)。

劉永政(1994- )，男，黑龍江牡丹江人，本科生，專業(yè)：生物工程。*通訊作者，副研究員，博士，從事作物遺傳育種及高產栽培生理研究。

2016-06-20

S 565.1

A

0517-6611(2016)22-166-03