尼羅羅非魚干擾素調節因子1的表達與細胞定位

王　丹,解文杰,朱葉飛,趙金良,陳曉武

(上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室,上海　201306)

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尼羅羅非魚干擾素調節因子1的表達與細胞定位

王丹,解文杰,朱葉飛,趙金良,陳曉武

(上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室,上海201306)

為了分析尼羅羅非魚干擾素調節因子1(IRF1)的表達規律及其功能,克隆了尼羅羅非魚IRF1基因cDNA全長,與其他脊椎動物IRF1基因進行比對,構建IRF家族系統進化樹。然后使用PolyI∶C對尼羅羅非魚進行體內注射誘導抗病毒免疫反應,利用熒光定量PCR技術檢測處理組和對照組中尼羅羅非魚各組織IRF1基因的表達差異。最后構建尼羅羅非魚IRF1基因真核表達載體,對其進行細胞定位。結果表明,尼羅羅非魚IRF1有888 bp的開放讀碼框,編碼295個氨基酸的蛋白序列。該蛋白N端高度保守,并含有6個保守的色氨酸,具有DNA結合結構域。對蛋白相似率的計算發現尼羅羅非魚與斑馬魚IRF1相似度為52.1%。而與大鼠IRF1的相似率最低,為36.2%。IRF家族成員蛋白序列構建的系統進化樹顯示,IRF家族共分為4個亞群。將pCMV3-FLAG-IRF1真核表達載體轉染到Hela細胞中后,對IRF1進行細胞定位發現,尼羅羅非魚IRF1主要分布在胞質中,胞核中有少量分布。對尼羅羅非魚使用PolyI∶C進行體內注射誘導抗病毒應答反應,利用實時熒光定量PCR檢測到各個組織中IRF1在不同時間下的表達水平有顯著差異。本研究完成了尼羅羅非魚IRF1的表達和細胞定位,對各種脊椎動物IRF家族成員進行了系統進化分析,結果有助于深入了解干擾素系統在機體免疫系統中的調控機制。

干擾素調節因子;尼羅羅非魚;系統進化;細胞定位

干擾素調節因子(Interferon regulation factor,IRF)能夠調節干擾素基因(Interferon,IFN)的轉錄。至今為止,在哺乳動物中發現9個IRF成員(IRF1～9),鳥類中共有10個IRF家族成員被鑒定出(IRF1～10),而在魚類,IRF家族第11號成員IRF11只在斑馬魚等硬骨魚類中[1-2]。IRF除了可以誘導IFN的產生及抗病毒功能之外,還在細胞因子信號轉導、細胞生長及凋亡等方面發揮著廣泛作用[3-4]。所有的IRF家族成員在結構上均有較高的保守性,IRF基因N端由大約120個高度同源的氨基酸組成,為DNA結合結構域(DNA-binding domain,DBD)。在DBD結構域內有5個高度保守的色氨酸,形成螺旋-轉角-螺旋結構。通過DBD結構域,IRF基因能夠結合DNA以發揮各種生物學功能。IRF1由于能夠結合在Ⅰ型IFN的病毒誘導類增強子元件上誘導IFN的表達而最早被發現,隨后家族其他成員被陸續報道。除了IRF1外,其他IRF成員的羧基端均有一個能夠介導與其他轉錄因子互作的干擾素調節因子相關域(Interferon associate domain,IAD) 1區域[5]。而在IRF1亞家族羧基端為IAD2,能夠與IRF8發生互作。IRF1最先作為Ⅰ型干擾素基因病毒誘導增強子樣元件的調節子被發現,也是目前研究最多的IRF家族成員。IRF1能夠結合IFN啟動子調控域,誘導I型IFN的表達,參與機體抗病毒過程[6]。對哺乳動物IRF1的研究發現,IRF1能夠在各種細胞中組成性表達,不僅存在于細胞核中,也存在細胞質中。在斑馬魚中,IRF1與其他IRF成員相比,在免疫器官中表達量最高,并且病毒感染后的IRF1表達變化最為顯著[7]。通過利用IRF1基因構建質粒,并用熒光素酶分析發現草魚體內IFN的轉錄水平提高,從而證明IRF1是草魚IFN轉錄的正調節因子[8]。在魚類中,牙鲆的IRF1是較早被鑒定出來的。當被感染牙鲆彈狀病毒后,IRF1基因在牙鲆各組織中的表達量都出現增高[9]。IRF家族成員眾多,功能復雜,有的相互協同,也有相互拮抗的關系[7]。在細胞定位研究中也有不同之處。目前,在少數動物中有報道。魚類作為種類最多的脊椎動物,是研究IRF系統最好的選擇。

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)隸屬于鱸形目(Percifomes)、麗魚科(Cichlidae),其適應性強、食性廣、生長快、繁殖力高[10]。我國是尼羅羅非魚養殖的主要國家,現已成為主要淡水養殖品種。近年來,由于養殖密度高、養殖環境變化等原因導致養殖尼羅羅非魚發病率逐漸升高,威脅著尼羅羅非魚養殖業的健康發展[11-12]。對尼羅羅非魚抗病毒研究,特別是IRF家族在病毒性疾病中的功能研究還很少。尼羅羅非魚基因組已經比較完整,多數IRF家族成員已經被注釋,但尚需試驗驗證。IRF1表達水平相對其他IRF家族成員較高,也是重要的代表性成員。因此,本試驗以尼羅羅非魚為研究對象,對IRF1基因結構、系統進化、抗病毒效應、以及細胞定位方面進行分析探討。

1　材料和方法

1.1尼羅羅非魚養殖和取材

試驗用尼羅羅非魚是由上海海洋大學尼羅羅非魚種質資源試驗站提供的新吉富品系,選擇體重200 g左右的試驗魚,暫養于室內循環水養殖中心,試驗期間水溫25 ℃,每天投喂飼料2次,14 d后挑選攝食正常,體表完好無傷,健康狀況良好的尼羅羅非魚用于試驗。暫養后的尼羅羅非魚隨機分為2組。使用聚肌胞苷酸(PolyI∶C)對其中一組尼羅羅非魚進行腹腔注射以模擬病毒刺激。所使用的PolyI∶C購自Sigma公司,溶于滅菌后的磷酸緩沖液中,注射量為每克魚0.5 μg。另一組使用不含PolyI∶C的PBS腹腔注射作為對照。

1.2組織總RNA的提取

PolyI∶C處理12,24 h后,將處理組及對照組尼羅羅非魚用M-222麻醉,取腦、鰓、肝、脾和腎臟組織迅速凍存于液氮中,約30 mg組織在1 mL TRIzol進行裂解,裂解使用AP公司的裂解柱。RNA提取按照TRIzol說明書中的操作步驟進行。提取完畢后,使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整性,并用分光光度儀檢測 RNA 的產量和純度。合格的RNA 樣品存放于-80 ℃備用。

1.3IRF1基因的克隆

第一鏈cDNA合成使用逆轉錄PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司),具體操作按試劑盒說明書操作。接著對尼羅羅非魚IRF1 基因全長進行克隆。首先,利用GenBank數據庫中尼羅羅非魚IRF1(XM_003451380.3)預測序列設計引物OnIRF1F:TCCTGGAATCAAAGCAAATT,OnIRF1R:TGAGGGTAGCTCTGCAAACT。以對照組尼羅羅非魚頭腎為模板,對IRF1基因進行PCR擴增。PCR 反應條件為:94 ℃預變性 3 min;94 ℃變性 30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min 30 s,35個循環;72 ℃延伸 7 min。擴增產物經 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳并使用 DNA 凝膠回收試劑盒(Qiagen 公司)割膠回收,回收后的目的片段使用pGEM T-easy Vector (Promega公司)為載體進行連接,連接后轉染至DH5α大腸桿菌中培養擴增,后經菌液PCR鑒定,挑選陽性克隆提取質粒并使用EcoR Ⅰ進行酶切,電泳鑒定后,將樣品送至上海生工生物工程技術有限公司測序。

1.4序列比對和系統發育分析

獲得的IRF1序列使用DNAStar等軟件分析序列信息,確定其開放閱讀框進而預測氨基酸序列,并且在NCBI網站進行BlastP分析。從 GenBank 下載脊椎動物模式物種的IRF家族蛋白序列,使用ClustalX及MEGA6軟件對IRF家族成員蛋白序列進行比對和系統發育分析。用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹。MEGA軟件中鄰接法采用Poission correction替換模型和配對刪除法,系統樹分支的可信度測試采用100次重復抽樣檢驗。

1.5IRF1在不同組織中的表達和比較

根據尼羅羅非魚IRF1基因cDNA序列,設計1對基因特異引物qOnIRF1F:AACAGTCGAGATTG GCCCTG,qOnIRF1R:AGAGTTGTGTACTGTGGCCG。以β-actin作為內參基因,引物為qOnactbF:GAATC CTGCGGAATCCACGA,qOnactbR:ATTTACGCTCAG GTGGGGC。20 μL PCR 反應液中包括 2 μL cDNA 模板,10 μL 2 ×Roche SYBR Master Mix,正反向混合引物共0.8 μL (10 μmol/L)和 7.2 μL雙蒸水。反應程序為95 ℃預變性5 min;再運行 95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s退火共40 個循環;接著72 ℃延伸5 min,最后繪制熔解曲線,生物學重復每組3個(n=3)。每個樣品重復 3管以保證試驗的準確性,利用公式 2-ΔΔCt計算出每一個樣本IRF1 基因的相對表達量,使用GraphPad Prism 5軟件進行顯著差異分析和作圖。

1.6熒光表達載體構建和細胞定位

使用OnIRF1F和OnIRF1R擴增產物為模板,使用兩端包含限制性內切酶位點的引物IRF1-CMVs:GACAAGCTTATGCCAGTGTCAAGA (Hind Ⅲ)和IRF1-CMVa:GGCCTAGGTAAAGCAAAAGTGG (BamH Ⅰ),進行第2輪PCR,再經過克隆驗證。提取質粒進行雙酶切,和經過同樣酶切的p3XFLAG-CMV-10表達載體進行連接。構建重組質粒pCMV3-FLAG-IRF1,進行測序驗證。將構建好的載體轉染到培養的Hela細胞中,培養后進行免疫熒光染色,主要方法如下:轉染48 h后,使用3%的多聚甲醛固定細胞10 min;將固定好的細胞置于含0.2%TritonX-100的PBS溶液通透15 min;之后置于5%的山羊血清37 ℃封閉1 h,接著加入免抗FLAP抗體(1∶200稀釋濃度)37 ℃下孵育1 h;再使用FITC標記的抗山羊IgG二抗孵育1 h;使用PBS漂洗3次后,使用4′、6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核1 min,熒光顯微鏡下觀察和拍照。

起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAA)加粗顯示。下劃線為DBD結構域區。

2　結果與分析

2.1尼羅羅非魚IRF1基因序列特征

尼羅羅非魚IRF1基因克隆測序的結果顯示其讀碼框長度為888 bp,編碼295個氨基酸的蛋白序列(圖1)。蛋白質分子量是34.15 kDa。氨基酸含量最高的是絲氨酸(Ser,S),占12.0%,最低的是酪氨酸,占2.0%。蛋白序列不含信號肽。

比較斑馬魚、河鲀及尼羅羅非魚IRF1基因結構圖中可以看出,尼羅羅非魚IRF共有9個外顯子和8個內含子,尼羅羅非魚與河鲀比較接近。而斑馬魚只有8個外顯子和7個內含子,內含子區較長。可見,尼羅羅非魚IRF1基因與河鲀IRF1相比,基因排列基本一致,存在高度保守的基因組共線性關系,上下游包括了ACS16、FNIP1和SLC22A4等基因(圖2)。

A.羅非魚、河豚和斑馬魚IRF1基因結構。方框代表外顯子,水平線代表內含子,不保守外顯子和保守外顯子分別用黑色框和白色框表示,數字分別代表核苷酸數目。B.羅非魚、河豚和斑馬魚IRF1基因在基因組中的共線性分析。

A.Schematic diagram of gene structure ofIRF1 in tilapia,fugu and zebrafish.Exons were expressed as boxes,and introns as lines,black and white boxes indicated conserved and unconserved regions,and the figure means the number of nucleotides;B.Diagram to show gene synteny atIRF1 loci in nile tilapia,fugu and zebrafish.

圖2IRF1基因結構和共線性分析

Fig.2Analysis of gene structure and synteny ofIRF1

尼羅羅非魚和斑馬魚(Daniorerio)、虹鱒(Onchorynchusmykiss)等硬骨魚類及其他脊椎動物如雞(Gallusgallus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)及人(Homosapiens)IRF1比對結果顯示,IRF是一類結構特征上保守的轉錄因子家族。所有物種IRF1蛋白的N 端約120個氨基酸的同源性較高,越靠近C端,保守性越低。氨基酸的N端包含DBD結構域,而在C端含有IAD2結構域。在尼羅羅非魚IRF1氨基端DBD結構域內含有 IRF家族特有的色氨酸(Try,W)重復殘基,分別為第11,26,38,46,58及77位,共6個(圖3)。蛋白同源性分析結果顯示,尼羅羅非魚與斑馬魚的IRF1蛋白序列相似度最高,為52.1%，其次是鮭魚(44.3%)及虹鱒(42.6%),相似度最小的為大鼠(36.2%)。

選取脊椎動物亞門中的代表物種IRF家族各成員蛋白序列構建系統進化樹(圖4)。從圖4可以看出,13個IRF1蛋白聚集在一起,其中尼羅羅非魚IRF1 與黃鱔和青鳉IRF1相似性最高,而與親緣關系較遠的魚和其他脊椎動物IRF1相似性較低。其他IRF也基本聚集成單獨的家族,最后又分別聚為4大亞群:一支包含所有IRF1和IRF2;一支由IRF4、IRF8和IRF9組成;一支由IRF5和IRF6組成;一支由IRF3和IRF7組成。

2.2尼羅羅非魚IRF1 mRNA的組織特異性表達及刺激后的表達變化

尼羅羅非魚IRF1在腦、鰓、肝、脾和頭腎中均有表達。脾臟及鰓中IRF1表達量較高,而在腦中的表達量比其他組織低。尼羅羅非魚腹腔注射PolyI∶C 12 h后,除腦無顯著差異外,其他各組織的對照組和處理組均有顯著差異。差異最大的為肝臟,表達量約增加12倍。在處理24 h后,頭腎及脾臟中IRF1表達水平仍有顯著上調變化。在處理24 h后的各個組織中,IRF1表達水平均出現顯著上調(圖5)。

實線方框顯示DBD結構域,其中包括高度保守的6個色氨酸;虛線方框代表IAD2結構域。

2.3IRF1表達載體的構建及免疫熒光染色定位

構建真核表達重組質粒pCMV3-FLAG-IRF1,轉染Hela細胞并進行熒光染色,轉染重組質粒pCMV3-FLAG-IRF1的細胞能夠檢測到綠色熒光,說明IRF1重組蛋白能夠在細胞中正常表達,熒光主要定位在細胞質中,細胞核中也能檢測到少量綠色熒光蛋白。這表明尼羅羅非魚IRF1主要在細胞質中表達(圖6)。

3　討論

尼羅羅非魚作為重要的經濟養殖品種,近10年在我國的產量以平均每年9%左右的速度遞增,穩居世界首位。其養殖產量約占世界總產量50%。但隨著尼羅羅非魚養殖規模擴大,各種傳染性疾病的發生呈現不斷增長的趨勢,尤其是近年來鏈球菌病和一些病毒性疾病的大范圍流行,給尼羅羅非魚養殖產業造成了嚴重的經濟損失[11]。因此,對于尼羅羅非魚免疫學的研究越來越受到重視。

隨著尼羅羅非魚基因組信息的逐步完善,通過生物信息學方法能獲得大量注釋的編碼基因,包括IRF家族的成員。但是相關結果仍然需要進一步的試驗驗證,但尼羅羅非魚IRF1基因的功能研究也未見報道。通過將尼羅羅非魚與其他脊椎動物的IRF1氨基酸序列進行多重比對后發現,IRF1家族蛋白序列比較保守。特別是氨基端有高度保守的DBD結構域,并含有6個色氨酸殘基,說明尼羅羅非魚IRF1蛋白序列擁有保守的二級結構特征。在羧基端,IRF1和IRF2具有與其他成員不同的IAD2結構域。盡管IRF1和IRF2序列比較接近,但是在干擾素轉錄調節及促細胞生長方面具有不同的效應[13-14]。IRF1具有激活干擾素轉錄功能,而IRF2通過與IRF1競爭相同的順式調控元件而發揮相反的抑制作用[15]。通過來自脊椎動物的IRF家族基因蛋白序列系統進化樹顯示,IRF1～IRF 9都可以單獨聚為1支。而IRF家族又可分為四大支:IRF1 亞家族;IRF4亞家族;IRF5亞家族和IRF3亞家族。結果表明IRF在分化中的時間上先后不同。

系統樹構建使用MEGA 6.0軟件,根據Neighbor-joining法進行計算,自舉檢測100次重復檢驗,蛋白序列來自GenBank數據庫。

IRF1基因表達量計算以β-actin作為內標,每組至少3條魚,每組計算mean±SEM;*.P<0.05。

A.IRF1在細胞中表達的熒光照片;B.細胞核DAPI染色;C.IRF1熒光染色和DAPI染色圖像重合。

作為低等脊椎動物,魚類具有固有免疫和適應性免疫[16]系統。由于魚類適應性免疫系統的不完善,固有免疫系統在魚類整個免疫系統中占十分重要的地位。固有免疫利用模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)對細菌、病毒等病原體中保守結構、病原體相關分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)進行識別,從而引起免疫反應[17]。在識別PAMPs的過程中,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是研究最多的模式識別受體之一,能夠誘導I型干擾素的表達,從而使機體形成抗病毒狀態。I型IFN系統在固有免疫及適應性免疫系統中扮演重要的角色,能參與抗病毒免疫反應,抑制腫瘤細胞調節,巨噬細胞活性及T、B淋巴細胞增殖[18-20]。而這些過程離不開IRF家族成員的參與。IRF家族為IFN重要的轉錄調控因子。關于哺乳動物IRF家族功能的研究表明,IRF1、IRF3、IRF5和IRF7能夠參與I型干擾素的正反饋調節,以此發揮抗病毒作用[21]。如在哺乳動物TLR信號通路中,當機體受到病毒感染時,細胞質中的IRF3受到磷酸化并向細胞核轉移,以激活IFN-beta的低量表達。而IFN-beta又能促進IRF7的大量表達,從而IRF3和IRF7的大量表達激活I型干擾素及抗病毒基因的表達。在魚類中已有十幾種魚類IRF1的研究,包括虹鱒、河鲀、斑馬魚及草魚等硬骨魚類。經聚肌胞苷酸刺激的魚類,其各個組織中IRF1的表達量會出現顯著上調[22-24]。在草魚抗病毒感染的過程中,IRF3在受到刺激后能大量表達,從而誘導IFN和ISG的轉錄[25]。對斑馬魚的研究顯示,IRF1與其他IRF家族成員相比,在免疫器官中的表達量最高,并且病毒感染后的IRF1表達變化最為顯著[7]。對牙鲆IRF1的研究發現,IRF1能夠使機體形成抗病毒狀態[15]。因此,在牙鲆的養殖過程中,IRF1可以作為一種DNA疫苗輔劑而增強魚體抗病能力。本試驗結果顯示了尼羅羅非魚各種組織能表達IRF1,其表達量也會隨著組織種類的不同而不同。試驗利用熒光定量PCR技術檢測尼羅羅非魚各組織中IRF1表達量,發現IRF1基因在脾臟和鰓中表達量較高,腦中的表達水平較低。同時利用聚肌胞苷酸PolyI∶C模擬病毒刺激,促使尼羅羅非魚產生抗病毒免疫反應。結果顯示,各個組織中IRF1的表達量會出現顯著上調趨勢。可見,IRF1對病毒刺激有相同的反應模式,其功能具有保守性。

對哺乳動物IRF1細胞定位的研究發現,IRF1主要存在于細胞核中,少量在細胞質中[26-27]。而斑馬魚IRF1在正常狀態下主要存在于細胞質中,經過刺激后會聚集在細胞核中[7]。為了對尼羅羅非魚IRF1進行細胞定位,本試驗構建IRFl融合蛋白的真核表達載體pCMV3-FLAG-IRF1。轉染到Hela細胞進行細胞定位,這種方法可以方便地使用抗flag的抗體來識別目的蛋白,有利于目的蛋白檢測和分離純化[28]。免疫熒光染色結果顯示,尼羅羅非魚IRF1蛋白能在Hela細胞中表達,而且在細胞質中表達更多,在細胞核中僅存在少量表達。結果和斑馬魚IRF1的研究結果比較接近,和哺乳動物結果有一定差異,推測與表達的蛋白種類和選擇的細胞類型有關系。本試驗對尼羅羅非魚IRF1基因進行克隆,系統分析和細胞定位,初步探討了其在抗病毒中的組織表達和反應模式。這些結果將有助于更深入了解脊椎動物干擾素表達調控的特點,為尼羅羅非魚抗病研究提供基礎理論依據。

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Expression Characterization of Interferon Regulatory Factor 1 in Nile Tilapia

WANG Dan,XIE Wenjie,ZHU Yefei,ZHAO Jinliang,CHEN Xiaowu

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Shanghai Ocean University,Ministry of Education,Shanghai201306,China)

In order to study the expression and function of interferon Regulatory Factor (IRF1) in nile tilapia,the full length cDNA ofIRF1 was cloned and applied for phylogenetic analysis,and the expression variation was checked by qRT-PCR after PolyI∶C stimulation.Cell transfection by eukaryotic expression vector was used to analyzing for subcellular localization.The opening reading frame of nile tilapiaIRF1 contains 888 bp with deduced protein of 295 amino acids.Structurally,nile tilapia IRF1 protein typically shares the conserved characterizations with other species′ IRF1 homologues,displaying conserved DNA-binding domain,IRF association domain,serine-rich C terminal domain,and 6 tryptophan residues in the N terminal.The results of phylogenetic analysis showed that the IRF family was divided into four subfamily:IRF1,IRF3,IRF4 and IRF5.The nile tilapia IRF1 was found to be merged into the teleost subgroup,amphibian and mammalian homologues were clustered into their corresponding subgroups.Real-time PCR revealed a broad expression pattern of nile tilapiaIRF1 in various tissues.The expression ofIRF1 was mainly in the head kidney,spleen,liver and gill,furthermore,which increased obviously after PolyI∶C stimulation,especially for the spleen and head kidney.Subcellular localization analysis showed that nile tilapia IRF1 mainly resides in the cytoplasm.These data supported the view that nile tilapia IRF1 was a potential molecule in IFN immune defense system against viral infection.

Interferon regulatory factor;Nile tilapia;Phyletic evolution;Subcellular localization

2016-02-25

現代農業產業技術體系專項(CARS-49);水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心 (ZF1206)

王丹(1991-),女,安徽淮南人,在讀碩士,主要從事魚類免疫學研究。

陳曉武(1976-),男,安徽六安人,副教授,博士,主要從事水生生物分子遺傳學研究。

Q785;S917

A

1000-7091(2016)04-0031-08

10.7668/hbnxb.2016.04.006