番茄褪綠病毒CP基因克隆、序列分析及原核表達

韓　磊,遲勝起,張劍峰

(青島農業大學 農學與植物保護學院,山東 青島　266109)

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番茄褪綠病毒CP基因克隆、序列分析及原核表達

韓磊,遲勝起,張劍峰

(青島農業大學 農學與植物保護學院,山東 青島266109)

為制備番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)抗血清,以番茄病葉為試驗材料,提取總RNA,根據ToCVCP基因設計特異性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,構建原核表達載體pET32a-ToCVCP,在大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中表達CP蛋白。結果表明:ToCVCP基因(GenBank登錄號:KT809400)全長774 bp,編碼257個氨基酸,與GenBank中其他地區分離物核苷酸序列同源性為97.2%～99.6%,推導的氨基酸序列同源性為97.3%～100.0%。核苷酸序列保守位點占全部位點的91.3%,氨基酸序列保守位點占全部位點的88.3%,表明不同地理來源的番茄褪綠病毒的CP基因保守性較高。將ToCVCP基因克隆到原核表達載體pET-32a(+)上,并在體外條件下誘導表達出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,轉 pET32a-ToCVCP載體的大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株表達了分子量約33 kDa的重組蛋白。該重組蛋白在37 ℃,1.0 mmol/L IPTG、誘導6 h,表達量最大。

番茄褪綠病毒;外殼蛋白基因;原核表達;基因克隆

番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)往往能引起番茄老葉葉片黃化,葉邊緣區域輕微卷曲,新生葉片起初沒有癥狀,但隨著病害的發展,葉脈間逐漸壞死,葉片變脆[1]。番茄褪綠病毒病發病初期與某些缺素癥狀相似,往往被認為是營養失調所致。1998年,該病毒在美國佛羅里達州首次發現[2],2004年在我國臺灣首次發現并報道了ToCV[3],隨后在國內多個省市的溫室番茄植株上檢測出了ToCV的發生[4-7]。

番茄褪綠病毒屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus),其基因組為正義單鏈RNA分子,5′端有甲基化帽子結構,3′端無Ploy(A)尾巴[8]。不能通過汁液摩擦傳播,可由粉虱傳播。ToCV可以侵染茄科、菊科、藜科、莧科、番杏科、夾竹桃科及白花丹科等多種植物[9]。其中以茄科寄主數目最多,如:番茄[10]、甜椒[11]、馬鈴薯[12]等。單獨或與其他病毒復合侵染,可造成嚴重的經濟損失。

當前,國內對ToCV的鑒定多采用RT-PCR方法,未見應用血清學檢測的報道,尚未發現有商用ELISA檢測試劑盒,因此制備高純度的ToCV抗血清十分必要。利用原核表達技術為基礎制備抗血清,克服了通過提純的病毒粒子為抗原制備抗血清的弊端,而且能夠獲得表達量大且特異性高的抗血清。本試驗構建了原核表達載體pET32a-ToCVCP,并轉化到大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中進行誘導表達,優化了原核表達條件,為制備ToCV高效價抗血清奠定了基礎。

1　材料和方法

1.1試驗材料

毒源采自山東省青島市,由青島農業大學病毒學實驗室保存。試劑:大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Rosetta(DE3)、質粒pET-32a(+)由本實驗室保存;TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶、T4DNA 連接酶、IPTG、RNAiso Plus、pMD18-T載體等購自TaKaRa公司;DNA回收試劑盒、質?？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┒锛夹g有限公司;各種限制性內切酶購自Fermentas公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2引物設計

根據 GenBank 中 ToCVCP基因的序列,利用Primer Premier 5.0軟件設計了一對特異性引物P1/P2,序列見表1。

表1　引物信息

注:下劃線處分別為BamH Ⅰ、SalⅠ酶切位點。

Note:The underlined wereBamH Ⅰ,SalⅠ endonuclease sites.

1.3總RNA提取

稱取番茄病葉0.1 g,加液氮研磨成粉末,采用TaKaRa公司的RNAiso plus試劑提取總RNA,具體操作參考使用說明書。

1.4RT-PCR擴增

cDNA合成反應體系(10 μL):DEPC水3 μL、RNA模板2 μL、下游引物P2(10 μmol/L)0.5 μL,70 ℃保溫10 min,立刻放置于冰上冷卻2 min,再依次加入5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL、M-MLV (200 U/μL) 0.25 μL、RNasin(40 U/μL) 0.25 μL。42 ℃保溫1 h,70 ℃ 15 min,4 ℃ 5 min,-20 ℃保存備用。

PCR反應體系(25 μL):ddH2O 17 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL、cDNA 2 μL、上游引物P1(10 μmol/L) 0.5 μL、下游引物P2(10 μmol/L) 0.5 μL、Taq酶(TaKaRa)(5 U/μL) 0.5 μL。擴增條件為94 ℃預變性3 min;循環參數:94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環30次;循環結束后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像儀上觀察結果。

1.5CP基因序列測定及分析

PCR產物經回收純化后,與pMD18-T載體16 ℃過夜連接。將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中,通過菌液PCR篩選陽性克隆pMD18-ToCVCP,委托上海生工生物工程有限公司進行測序。序列與NCBI數據庫進行Blast比對分析,用DNAMAN 6.0軟件進行序列比對分析,并采用MEGA 5.1軟件構建系統發育樹。

1.6原核表達載體的構建和鑒定

用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切陽性重組質粒pMD18-ToCVCP和原核表達載體pET-32a(+)。然后在T4DNA 連接酶的作用下,構建重組表達載體pET32a-ToCVCP,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經菌液PCR篩選陽性菌落,提取重組質粒,經酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.7CP蛋白原核表達及SDS-PAGE分析

將重組質粒pET32a-ToCVCP轉入大腸桿菌Rosetta(DE3),挑取單菌落,接種至含100 μg/mL氨芐青霉素LB培養基中,37 ℃活化過夜,按1∶100比例接種于含氨芐青霉素的LB培養基中,37 ℃、200 r/min培養3～4 h,至OD600達到0.4～0.5時,分別加入不同濃度的(0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)IPTG,繼續培養。8 000 r/min 離心2 min收集菌體,加入適量的ddH2O懸浮,通過SDS-PAGE電泳檢測表達情況。

2　結果與分析

2.1ToCVCP基因擴增及克隆

以總RNA為模板,利用特異性引物(P1/P2)進行RT-PCR擴增,得到了1條約774 bp 的特異性條帶(圖1)。將擴增出的目的片段回收純化,與pMD18-T載體連接后委托上海生工公司測序。

1.陰性對照;2.RT-PCR 產物;M.DL2000 Marker。

2.2ToCVCP基因的序列分析

克隆得到的ToCV青島分離物CP基因(GenBank登錄號:KT809400),片段全長774 bp,編碼257個氨基酸,分子量約28 kDa。其中含有 227個A、210個T、149個C、188個G,各堿基在CP基因中的百分比分別是29.3%,27.1%,19.3%,24.3%(圖2)。將獲得的ToCVCP基因序列,進行Blast比對分析發現,各分離物間核苷酸序列的同源性為97.2%～99.6%。利用DNAMAN 6.0軟件將ToCV青島分離物與33個標明采集區域的ToCVCP基因序列分析對比后發現,保守位點707個,占全部位點的91.3%;變異位點67個,占全部位點的8.7%;沒有缺失和插入。而且在整個開放閱讀框中,3′端的同源性要好于5′端(圖3)。將ToCV青島分離物CP基因推導的氨基酸序列進行比對后發現,同源性為97.3%～100.0%,保守位點227個,占全部位點的88.3%;變異位點30個,占全部位點的11.7%。結果表明,不同地理來源的番茄褪綠病毒的CP基因保守性較高。

經Blast比對分析發現，ToCV青島分離物CP基因核苷酸序列與GenBank中ToCV登錄號分別為KP335046.1、KP217196.1、KP137099.1、KP114534.1、KC887999.1、AB513443.1(分別表示中國、中國、韓國、韓國、中國、日本分離物)的同源率最高,達99.6%。與DQ136146.1(西班牙分離物)的同源率最低,為97.2%。氨基酸序列與GenBank中ToCV登錄號為YP293703.1(美國分離物)的同源性達100%。與AAZ77652.1(西班牙分離物)的同源率最低,為97.3%。采用MEGA 5.1軟件用Neighbour-joining方法構建ToCVCP基因核苷酸序列系統發育進化樹(圖4)。從構建的系統發育進化樹可以看出,中國、日本、美國、巴西、以色列、希臘、韓國等分離物在一個分支上,而西班牙、法國等分離物在另一個大的分支上。青島地區分離物CP基因序列與中國、韓國、日本、美國距離較近,與巴西、以色列、希臘距離稍遠。

圖2　ToCV CP基因核苷酸序列

2.3原核表達載體的鑒定

重組質粒經菌液PCR鑒定后,得到了約為774 bp的特異性片段(圖5)。回收純化質粒,用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切陽性重組質粒pET32a-ToCVCP,酶切片段大小也為774 bp目的片段(圖6),表明CP基因已連接至pET-32a(+)原核表達載體上。

圖3　不同ToCV分離物CP基因核苷酸序列5′端和3′端比對

圖4　ToCV青島分離物與其他分離物CP基因核苷酸序列系統發育樹

2.4體外誘導表達及SDS-PAGE分析

通過優化原核表達誘導條件,結果表明,1.0 mmol/L IPTG、37 ℃誘導6 h,重組質粒pET32a-ToCVCP在大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中的蛋白表達量最高。經SDS-PAGE電泳顯示,在約33 kDa處誘導出一個特異性的融合蛋白,與預期大小基本一致(圖7)。表明ToCVCP基因在Rosetta (DE3)菌株中得到了正確的表達。

M.DL2000標記;1～4.PCR鑒定。

M.DL2000標記;1.pET32a-ToCVCP重組質粒；

M.蛋白質Marker;1.IPTG誘導的重組載體;2.未經IPTG誘導的重組載體;3.經IPTG誘導的空載體。

3　討論

病毒的外殼蛋白在寄主癥狀、病毒長距離和細胞間運輸、病毒的介體傳播、病毒的免疫原性等方面起著重要的作用。Adams等[13]報道,病毒的CP基因核苷酸序列變異情況能夠反映出全基因組的變異情況。本試驗利用RT-PCR方法成功克隆了ToCV的外殼蛋白基因,并在核酸水平進行了分析鑒定。結果表明,該序列大小為774 bp,編碼257個氨基酸。ToCV病毒CP基因與 GenBank 中不同分離物核苷酸同源性為97.2%～99.6%,推導的氨基酸同源性為97.3%～100.0%,核苷酸保守位點占全部位點的91.3%。表明不同地理的番茄褪綠病毒的CP基因雖然存在差異,但整體有較高的保守性,且在整個開放閱讀框中,3′端的同源性要好于5′端。其推導的氨基酸序列也具有相似的結論。構建的系統發育樹表明,ToCV青島地區分離物CP基因序列(GenBank登錄號:KT809400)與中國、韓國、日本、美國等分離物的關系較近,說明該分離物或許源于上述國家。

血清學檢測技術仍然是目前病毒檢測中應用最為廣泛的技術,具有簡便、快速、批量檢測樣品等優點,其中制備高效價、特異性強的抗血清是關鍵的一步。傳統的方法是利用提純病毒粒子,以其作為抗原免疫動物,獲得的抗血清中含有抗體。這種方法缺點是會引起非特異性反應,且大多數植物病毒粒子很難得到提純。ToCV病毒能通過粉虱進行傳播,而且在植物寄主上還能與多種病毒復合侵染,因此，通過提純病毒粒子作為抗原制備抗體存在困難。目前,利用原核表達的方法,在大腸桿菌中誘導表達病毒外殼蛋白,以表達的融合蛋白作為抗原制備特異性抗體能達到很好的免疫效果[14]。Jacquemond等[15]成功應用血清學的檢測技術檢測ToCV。近年來,國內關于病毒檢測方面的報道,如蘋果莖溝病毒[16]、李矮縮病毒[17]、水稻黑條矮縮病毒[18]、番茄黑環病毒[19]、番茄黃化曲葉病毒[20]、黃瓜花葉病毒[21]、甘薯褪綠斑病毒[22],均采用了原核表達的方法獲得抗原制備抗血清,因此,本試驗克隆ToCV外殼蛋白基因,成功構建了原核表達載體,以37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、誘導6 h條件下可獲得高效表達的外殼蛋白,為制備ToCV特異性抗血清及其血清學檢測的研究提供了參考依據。

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Cloning,Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of Coat Protein Gene ofTomatochlorosisvirus

HAN Lei,CHI Shengqi,ZHANG Jianfeng

(College of Agronomy and Plant Protection,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China)

In order to prepare the special antiserum ofTomatochlorosisvirus(ToCV),the total RNA of tomato leaves infected with ToCV were extracted.According to the coat protein gene of ToCV,specific primers were designed to amplify the coding region of coat protein by RT-PCR,the prokaryotic expression vector pET32a-ToCVCPwas constructed and the recombinant protein was expressed inE.coliRosetta (DE3).The results showed that the ToCVCPgene(NCBI:KT809400)owned 774 bp nucleotides,encoding 257 amino acids.The similarity of nucleotide and predicted protein were 97.2%-99.6% and 97.3%-100.0%,respectively,compared with theCPgene of other ToCV isolates registered in GenBank.The nucleotide sequence of conserved sites accounted for 91.3% of all loci,the amino acid sequence conserved sites accounted for 88.3% of all loci,indicated that the geographical origin of different ToCVCPgene had a relative higher conservative property.The ToCVCPgene was subcloned into the expression vector pET-32a(+) and the fusion protein was expressedinvitro.SDS-PAGE analysis showed that a specific recombinant protein of approximately 33 kDa was produced in the Rosetta (DE3) with the prokaryotic expression vector pET32a-ToCVCPin 37 ℃with 1.0 mmol/L IPTG for 6 hours.

Tomatochlorosisvirus;Coat protein gene;Prokaryotic expression;Gene cloning

2016-06-11

山東現代農業產業技術體系薯類創新團隊項目(SDAIT-10-011-06)

韓磊(1990-),男,山東棗莊人,在讀碩士,主要從事植物病理學研究。

遲勝起(1970-),男,山東海陽人,副教授,博士,主要從事植物病理學研究。

張劍峰(1964-),男,內蒙古呼和浩特人,教授,博士,主要從事植物病理學研究。

Q78;S641.03

A

1000-7091(2016)04-0057-06

10.7668/hbnxb.2016.04.010