紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表達分析

張　偉,姬明麗,郭前進,千智斌

(新鄉醫學院 基礎醫學院,河南 新鄉　453003)

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紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表達分析

張偉,姬明麗,郭前進,千智斌

(新鄉醫學院 基礎醫學院,河南 新鄉453003)

為了研究紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2基因的功能及在脂肪代謝中的分子機制,從紅鰭東方鲀脂肪組織提取總RNA,反轉錄獲得cDNA模板,利用設計的引物PCR擴增獲得SREBP-1和SREBP-2開放閱讀框(ORF),SREBP-1基因ORF區的cDNA序列長度為3 330 bp,編碼1 109個氨基酸,SREBP-2基因ORF區的cDNA序列為3 444 bp,編碼1 147個氨基酸。實時熒光定量PCR檢測SREBP-1基因在紅鰭東方鲀不同組織中的表達特征,結果表明,SREBP-1在腦組織中表達豐度最高,其次為眼、脂肪組織、腸、鰓、脾臟、心臟及肝臟,在肌肉中表達豐度最低。將SREBP-1連接到原核表達載體pET32a上,利用IPTG對重組質粒pET32a-SREBP-1在大腸桿菌Rosetta(DE3)進行誘導表達,SDS-PAGE電泳顯示在141 kDa處有特異性的條帶出現。

紅鰭東方鲀;SREBP-1基因;SREBP-2 基因;原核表達

固醇調節元件結合蛋白(SREBPs)是一類含有堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈(bHLH-zip),參與調控脂肪酸、膽固醇和甘油三酯合成與吸收的重要轉錄因子,對脂質穩態維持起著重要的作用[1]。SREBPs家族包含SREBP-1和SREBP-2這2個基因,分別位于17,22號染色體上[2]。SREBP-1基因因各自不同啟動子的選擇性剪切形成2個剪切體,分別為SREBP-1a和SREBP-1c,兩者的氨基酸序列長度不同,SREBP-1c的序列較長。SREBP-2 基因定位于22號染色體,其結構上有一段較長酸性激活域[3],并與SREBP-1a酸性激活域的結構較為相似。Hua等[4]研究發現,SREBP-1和SREBP-2蛋白的結構較為相近,有40%～50%的同源性,物種間也有差異。SREBP-1c是調節脂肪代謝的重要核內轉錄因子,其主要在肝細胞和脂肪細胞中表達,同時在脂肪細胞分化中有著至關重要的作用[5]。SREBP-1在動物的各種組織中都有表達,如小鼠和人的肌肉中[6],以及禽類的腸道及脂肪組織等[7]。SREBP-1作為轉錄因子家族SREBPs的成員之一,研究證實其通過調控FoxO1、PPARγ等脂肪代謝相關基因的表達,從而調節脂肪代謝的機制。

目前,對于魚類SREBP的研究開展的工作較少,筆者所在課題組之前對紅鰭東方鲀SREBP-1進行了電子克隆及生物信息學分析[8]。本研究克隆了紅鰭東方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因完整的ORF序列,檢測SREBP-1基因在不同組織的表達,并進行原核表達,為深入研究SREBP基因調控脂肪代謝的分子機制奠定了基礎。

1　材料和方法

1.1試驗材料

供試動物為紅鰭東方鲀,取材時將其放在冰上麻醉,取出腦、眼、脂肪組織、腸、鰓、脾臟、心臟、肝臟、肌肉組織9個組織,用滅菌的DEPC處理水沖洗后,在液氮速凍1 h后取出,-80 ℃保存備用。

1.2SREBPs基因的電子克隆

SREBP-1基因的電子克隆已完成[8]。以大黃魚SREBP-2的氨基酸序列(KKF13222.1)為探針在河豚的基因組數據庫(http://genome.jgi-psf.org/Takru4/Takru4.home.html)中進行Blast分析,搜索到與已知的SREBP-2 存在相似性的片段作為紅鰭東方鲀SREBP-2 的預測基因。

1.3SREBP-1和SREBP-2 ORF的克隆

利用TRIzol試劑(Invitrogen公司,美國)從肝臟組織抽提總RNA,以總RNA為模板,利用SuperScript Ⅲ reverse transcriptase(Invitrogen公司,美國)合成cDNA第1條鏈。根據電子克隆獲得的SREBP-1、SREBP-2基因序列,在ORF區兩端設計引物見表1,RT-PCR擴增條件為：94 ℃變性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,總計35個循環,最后72 ℃充分延伸10 min。將PCR產物連接于pGEM T-easy載體(Promega公司,美國),連接產物轉化大腸桿菌JM109,陽性克隆抽提質粒,送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4生物信息學分析

在NCBI網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi進行蛋白質結構域在線分析。利用DNAStar軟件中的Editseq程序對核苷酸和氨基酸序列進行理化性質分析。程序進行同源性分析。利用Mega 5.05軟件建立不同物種SREBP氨基酸序列的分子系統進化樹。

1.5實時熒光定量PCR檢測SREBP-1基因在不同組織的表達

以9種組織的總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板,利用SYBR Green染料法相對定量SREBP-1基因在不同組織的相對表達水平。根據SREBP-1 ORF區范圍內設計引物qSREBP1-F和qSREBP1-R(表1)用于RT-qPCR,以β-actin為內參進行表達差異研究。Real-time PCR程序如下：95 ℃ 5 min進行預變性;95 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,進行40 個循環。反應在IQ 5 Real-time System 熒光定量PCR儀上進行,每個cDNA樣品重復3次,利用2-ΔΔCt相對定量法計算相對表達量。

表1　引物序列

1.6原核表達載體的構建及鑒定

利用帶有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點的引物SREBP-1-EcoRⅠ和SREBP-1-SalⅠ(表1)擴增紅鰭東方鲀SREBP-1基因ORF序列,與pGEM-T Easy載體連接,轉化到大腸桿菌。pGEM-T-SREBP-1和pET32a質粒采用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切3 h,瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的條帶和載體,用T4DNA連接酶過夜連接后轉化到JM109大腸桿菌。將菌落PCR和雙酶切鑒定陽性的克隆,進行測序驗證。

1.7目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測

對pET32a-SREBP-1重組質粒轉化到Rosetta(DE3)大腸桿菌中,在平板上隨機挑取克隆進行菌落PCR鑒定陽性克隆接種到含氨芐青霉素的LB液體培養基,37 ℃過夜振蕩培養,按1∶50的比例轉接到20 mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中,振蕩培養至OD值為0.6～0.8時,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,37 ℃誘導5 h后離心進行菌體的收集,利用超聲波破碎,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,收集上清。把PBS緩沖液加到沉淀組分中懸浮。將上清和沉淀測定濃度,SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。

2　結果與分析

2.1SREBP基因的序列測定和分析

根據電子克隆得到的序列設計引物,經RT-PCR擴增后,電泳檢測到3 330,3 444 bp的目的條帶(圖1),符合預期紅鰭東方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因的ORF區的大小。測序結果表明SREBP-1、SREBP-2 基因序列的全長分別為3 330,3 444 bp。根據克隆得到的紅鰭東方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因ORF區的序列利用DNASTAR軟件推測其氨基酸序

M.DNA分子質量標準;1.SREBP-1;2.SREBP-2。

圖2　紅鰭東方鲀SREBP-2 基因cDNA序列及其推導的氨基酸序列

列,發現SREBP-1編碼氨基酸為1 109個,與電子克隆結果一致[8],SREBP-2 編碼1 147個氨基酸(圖2),理論等電點為8.22,分子質量為125.53 kDa。對紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2蛋白進行功能域的分析,其氨基端均有1個SREBPs家族的保守的結構域——堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈結構(bHLH-zip)。

將紅鰭東方鲀SREBP-2蛋白的氨基酸序列與其他物種進行同源性分析,發現與大黃魚的同源性最高為82%,與尼羅羅非魚、青鳉的同源性較高,分別為80%,76%。利用Mega 5.05以鄰位相接(N-J)構建不同物種SREBP蛋白的分子系統進化樹(圖3)發現：分子進化樹分為SREBP-1、SREBP-2兩大支。SREBP-1又分為2個小支,紅鰭東方鲀SREBP-1與其他魚類聚為1支,另1支為哺乳動物類。紅鰭東方鲀SREBP-1與黃斑藍子魚的親緣關系最近,與哺乳動物親緣關系較遠。SREBP-2也分為2小支,1支為紅鰭東方鲀SREBP-2與其他魚類,另外1支為哺乳動物聚為另外1支。進化分析發現,紅鰭東方鲀SREBP-2與大黃魚的親緣關系最近,與哺乳動物親緣關系較遠。

圖3　紅鰭東方鲀SREBP與其他生物的系統進化樹

2.2SREBP-1基因在不同組織的表達分析

利用RT-qPCR技術對SREBP-1在紅鰭東方鲀的9種組織轉錄水平的表達分析進行檢測,發現SREBP-1基因在腦中的表達量最高,其次是眼、脂肪組織、腸、鰓、脾臟、心臟及肝臟,在肌肉組織中的表達量最低(圖4)。

2.3pET32a-SREBP-1重組表達質粒的鑒定

用EcoRⅠ和SalⅠ對重組表達質粒pET32a-SREBP-1進行雙酶切鑒定(圖5),1條為載體,1條為目的條帶。測序結果表明,所測序列沒有堿基缺失及變異,故初步確認所構建的pET32a-SREBP-1重組表達質粒是成功的,可以進行下一步試驗。

2.4融合蛋白的表達與純化

將重組質粒pET-32a-SREBP-1轉化到大腸桿菌Rosetta(DE3)并利用IPTG進行誘導5 h后,收集細菌并進行超聲波破碎,利用SDS-PAGE電泳進行檢測,發現IPTG誘導后pET-32a-SREBP-1,出現約141 kDa的蛋白條帶(圖6),與推測的相符。在上清中含有目的蛋白較多,故融合蛋白是可溶性的。

圖4　SREBP-1基因的組織表達特性

M.DNA分子量標準；1.pET-32a-SREBP-1質粒雙酶切。

M.蛋白分子量標準；1.純化;2.沉淀;3.上清;4.總菌液;5.空白質粒。

M.Protein Marker;1.Purified recombinant SREBP-1 protein;2.Sedimentation;3.Supernatant;4.EscherichiacoliRosetta (DE3) contained pET32a are induced by IPTG;5.pET32a.

圖6重組質粒表達產物的SDS-PAGE分析

Fig.6SDS-PAGE analysis of expression of the SREBP-1 in Rosetta (DE3)

3　結論與討論

SREBPs有3種亞型：SREBP-1a調節所有SREBP的下游靶基因,主要調控脂肪酸,其次是膽固醇的合成;SREBP-1c主要是調節磷脂和甘油三酯的合成;SREBP-2主要調控膽固醇的合成[9-10]。哺乳動物的SREBP蛋白具有一個進化比較保守的功能域—bHLH-zip區域,是發生二聚化與DNA結合的區域[11]。生物信息學分析發現紅鰭東方鲀的SREBP-1和SREBP-2蛋白的氨基端都存在bHLH-zip區,因此，推測可能具有調控脂肪代謝的功能。因為SREBP-1基因在物種上的差異及可選擇的編碼序列的不同有SREBP-1a、SREBP-1c等不同的變體的存在[12-14]。然而，在魚類中只有SREBP-1基因[15]，該基因在魚類調控脂肪代謝的分子機制是魚類營養學中重要的研究課題[9,16-18]。但魚類的SREBP-1基因否具有哺乳動物的SREBP-1a和SREBP-1c的功能還有待研究。

紅鰭東方鲀組織表達分析發現SREBP-1在所有檢測的組織中均有表達,在大腦組織中表達的最高。藍子魚SREBP-1基因在腦、眼和腸道中的表達量相對比較高[19]。大西洋鮭魚SREBP-1基因在腸道的表達水平最高,其次是大腦和鰓[15]。哺乳動物SREBP-1a和SREBP-1c在組織中表達也有差異,SREBP-1c在脂肪組織中表達量最高,SREBP-1a是在肝臟中表達量最高[12]。研究表明,雞SREBP-1基因主要在腹部脂肪和心臟中的表達量較高,而在肝臟、胃、脾臟、腎臟等組織中表達量較低[20]。由此可見,紅鰭東方鲀SREBP-1基因的組織分布和魚類的較為接近,尤其是黃斑藍子魚,與哺乳類動物有比較大的差異,可能因為魚類合成脂肪酸的主要部位在大腦,而哺乳動物脂肪酸合成主要在肝臟和脂肪組織。

為了進一步研究SREBP-1蛋白的功能,將紅鰭東方鲀SREBP-1基因克隆到原核表達載體pET-32a,成功構建了重組表達質粒pET-32a-SREBP-1,利用IPTG進行誘導在大腸桿菌中的表達。收集菌液進行超聲波破碎,鑒定在上清和沉淀中是否有目的蛋白的表達。結果發現上清中的表達量較多,利用SDS-PAGE電泳技術進行鑒定發現表達后的融合蛋白的分子質量大約為141 kDa。pET-32a-SREBP-1重組質粒的構建及SREBP-1融合蛋向的成功表達為抗體的制備及深入研究SREBP-1蛋白的功能提供了基礎的材料。

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Cloning and Expression of SREBP-1 and SREBP-2 in Torafugu Takifugu rubripes

ZHANG Wei,JI Mingli,GUO Qianjin,QIAN Zhibin

(School of Basic Medical Science,Xinxiang Medical University,Xinxiang453003,China)

In order to study the function and molecular mechanism ofSREBP-1 andSREBP-2, the open reading frames (ORF) of torafuguSREBP-1 andSREBP-2 genes were amplified from total RNA of adipose tissue by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The results showed that the ORF ofSREBP-1 was composed of 3 330 bp,encoding 1 109 amino acids,while the ORF ofSREBP-2 was composed of 3 444 bp,encoding 1 147 amino acids.The expression ofSREBP-1 gene in torafugu tissues was determined using Real-time quantitative PCR,presenting that the highest expression was in brain,followed in eye,adipose tissue,spleen,gill,intestine,heart and liver,but the lowest in muscle.The prokaryotic expression system of recombined vector pET32a-SREBP-1 was constructed successfully.SDS-PAGE analysis showed that the expressed protein accumulated and the molecular weight of expressed fusion protein was 141 kDa.

Takifugurubripes;SREBP-1 gene;SREBP-2 gene;Prokaryotic expression

2016-03-25

河南省教育廳重點項目(14A310027);新鄉醫學院高學歷人才啟動基金項目(505001)

張偉(1977-),男,河南長垣人,講師,博士,主要從事魚類脂質代謝的機制研究。

S917;Q786

A

1000-7091(2016)04-0074-06

10.7668/hbnxb.2016.04.013