去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體對人宮頸癌Hela細胞增殖作用研究

冀嬌嬌，董潔，王加利，袁將，陳心怡，趙爽，鄭尊善，劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102)

去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體對人宮頸癌Hela細胞增殖作用研究

冀嬌嬌，董潔，王加利，袁將，陳心怡，趙爽，鄭尊善，劉永剛*

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102)

目的：探討去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體對人宮頸癌Hela細胞增殖的抑制作用。方法：將去氫駱駝蓬堿單體制備成脂質(zhì)體形式并對其進行結(jié)構(gòu)表征；采用細胞毒性試驗CCK-8法檢測去氫駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體對Hela細胞增殖的體外抑制作用。結(jié)果：去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的粒徑分布集中，去氫駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體對Hela細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為3.83 μg·mL-1和2.84 μg·mL-1。結(jié)論：去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體形式可以增加其抗宮頸癌腫瘤活性。

去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體；Hela細胞；細胞增殖

去氫駱駝蓬堿(Harmine)屬于β-咔啉類生物堿，從蒺藜科(Zygophyllaceae)植物駱駝蓬PeganumharmalaL.的種子中提取得到。駱駝蓬為蒺藜科駱駝蓬屬(Peganum)多年生草本植物，民間常以種子或全草入藥[1]，是維吾爾族的習(xí)用藥材，主要用于消化道腫瘤的治療[2-4]。駱駝蓬植物的主要活性成分為生物堿，去氫駱駝蓬堿是其中的主要有效成分之一，含量較高，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[5]，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)和單胺氧化酶抑制作用、輻射防護作用、抗包蟲作用和和廣泛的抗腫瘤活性[6-12]。

雖然去氫駱駝蓬堿具有肯定的抗腫瘤作用，但是由于其具有較強的神經(jīng)毒性[13-16]，也限制了其在臨床的應(yīng)用。脂質(zhì)體作為藥物的載體，在體內(nèi)具有靶向性，可以改善藥物在體內(nèi)的分布行為，提高藥物療效，降低藥物的毒副作用。本實驗將去氫駱駝蓬堿制備成脂質(zhì)體形式，并對其進行體外抗腫瘤活性研究，以期提高該藥在體內(nèi)的抗腫瘤作用強度，為深入研究其抗腫瘤機理和新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與細胞

Malvern Zetasizer 3000HS光散射粒徑測定儀(Malvern instruments公司)，JY92-2D 超聲波細胞搗碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，脂質(zhì)體擠出儀(Avanti Polar Lipids，Inc.)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，Lio-Rad-680全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)；島津20A高效液相色譜儀，Aglient SB柱C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(三洋公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；96孔板(Costar公司)；人宮頸癌Hela細胞株由ATCC細胞庫提供。

1.2 藥品與試劑

去氫駱駝蓬堿，由本實驗室自制，從駱駝蓬飲片(購自新疆維吾爾自治區(qū)省藥材公司神州大藥房)中提取得到；0.25%胰蛋白酶-EDTA，胎牛血清，磷酸緩沖溶液(PBS)，雙抗(PS)，DMEM高糖培養(yǎng)基，均為Thermo公司生產(chǎn)；二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司生產(chǎn)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙二醇(DSPE-PEG2000，日本精化株式會社NFC)，磷脂(EPC，日本油脂株式會社)，膽固醇(Chol，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)。

2 方法

2.1 去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的制備

取去氫駱駝蓬堿1 mg加三氯甲烷10 mL超聲使其溶解，得去氫駱駝蓬堿三氯甲烷溶液。取磷脂(EPC)40 mg，膽固醇(Chol)25 mg，DSPE-PEG20001 mg置于梨形瓶中，加入去氫駱駝蓬堿三氯甲烷溶液溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氯甲烷溶液，加入pH 7.0的磷酸鹽緩沖液5mL超聲溶解。40 ℃水浴中攪拌30 min，超聲波細胞粉碎機超聲10 min，依次過0.45、0.22 μm的微孔濾膜各兩次，過100 nm的脂質(zhì)體擠出儀，放于-4 ℃冰箱中保存，即得。

2.2 脂質(zhì)體中的藥物定量檢測方法

采用高效液相色譜方法測定脂質(zhì)體中去氫駱駝蓬堿的含量。島津20A高效液相色譜儀，Agilent SB 柱C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5%氨水(25∶75)；檢測波長：320 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃。通過該方法，保證脂質(zhì)體中的載藥量和原料藥的含量一致。樣品溶解：精密吸取制備好的去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體溶液1 mL，用甲醇溶解，超聲10 min 破乳，甲醇定容至10 mL。

2.3 去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的表征

取去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體0.5 mL，加蒸餾水稀釋至10 mL，稀釋液加入樣品池中進行測定，以微粒的個數(shù)為基準，測定其粒徑、Zeta電位并繪制粒徑分布圖及電位圖。

2.4 CCK-8法觀察去氫駱駝蓬堿及其脂質(zhì)體對細胞生長的抑制作用

取對數(shù)生長期的Hela腫瘤細胞，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%PS)配成1×108·L-1。接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)24 h。吸出并更換培養(yǎng)基，加入用無血清培養(yǎng)基稀釋得到的5個濃度(2.5，5，10，20，40 mg·L-1)的去氫駱駝蓬堿及其脂質(zhì)體的DMSO溶液(DMSO終濃度≤0.2%)，每孔100 μL，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，對照組加入無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑培養(yǎng)3 h，振搖并置于酶標儀中測定450 nm和690 nm處的吸光度，實驗重復(fù)3次。以含DMSO的無血清培養(yǎng)基處理的腫瘤細胞為空白組，根據(jù)公式計算化合物對細胞的抑制率(cell inhibition，CI)。

抑制率=[1-(A450-A690)實驗組/(A450-A690)對照組]×100%

3 結(jié)果

3.1 去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的表征

所測得去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的平均粒徑為(108.32±5.46)nm，呈單峰正態(tài)分布，PDI=(0.161±0.01)，表明脂質(zhì)體的粒徑分布集中；所制備脂質(zhì)體略帶正電荷，Zeta電位為(5.34±0.41)mV。結(jié)果見圖1、2。

圖1 脂質(zhì)體粒徑分布圖

圖2 脂質(zhì)體Zeta電位分布圖

3.2 去氫駱駝蓬堿及其脂質(zhì)體的抗腫瘤活性

體外實驗中，去氫駱駝蓬堿及其脂質(zhì)體對Hela細胞均具有抑制生長的作用，不同藥物在同一濃度、同一時間對Hela細胞的抑制作用不同，去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體較去氫駱駝蓬堿抑制作用明顯，去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體對Hela細胞的IC50為2.84 mg·mL-1，去氫駱駝蓬堿對Hela細胞的IC50為3.83 mg·mL-1。見表1、2及圖3。

藥物質(zhì)量濃度/μg·mL-1A450-A690未加藥2 939±0 0370 6252 042±0 064??1 251 841±0 024??2 51 553±0 012??51 036±0 053??100 577±0 019??200 301±0 030??

注：與未加藥組比較，*P<0.05，**P<0.01，下同。

藥物質(zhì)量濃度/μg·mL-1A450-A690未加藥2 284±0 2100 6252 550±0 140??1 252 397±0 282?2 52 383±0 012??51 697±0 064??101 283±0 179??200 377±0 027??

圖3 去氫駱駝蓬堿及其脂質(zhì)體對Hela細胞的抑制率

4 討論

脂質(zhì)體在制備過程中，包封率和體外釋放度是評價脂質(zhì)體好壞的重要指標。由于本實驗的重點在于考察去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體形式對人宮頸癌的影響，故沒有對脂質(zhì)體進行包封率和體外釋放度的測定，下一步工作將重點研究。

去氫駱駝蓬堿及其脂質(zhì)體對Hela細胞增殖均具有體外抑制作用，并且去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的抗腫瘤活性更高，這不僅擴大了去氫駱駝蓬堿的應(yīng)用范圍，也為其新藥研發(fā)提供依據(jù)，同時對于我們深入研究去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體抗腫瘤活性的作用機制奠定了基礎(chǔ)，因此優(yōu)化去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的制備工藝，深入研究脂質(zhì)體與腫瘤部位靶向結(jié)合的作用，不但是我們今后需要進一步研究的科研方向，對于完善去氫駱駝蓬堿的研究體系、開發(fā)利用新疆植物藥資源駱駝蓬也具有不可估量的實際意義。

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EffectofHarmineLiposomeonProliferationofHumanCervicalCarcinomaCellLinesHeLa

JI Jiaojiao，DONGJie，WANGJiali，YUANJiang，CHENXinyi，ZHAOShuang，ZHENGZunshan，LIUYonggang*

(BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100102，China)

Objective：To probe the effect of harmine liposome on human cervical carcinoma cell lines HeLa.Methods：The harmine monomers were prepared into liposome form and its structure was characterized.The inhibitory effects of harmine and harmine liposome on the proliferation of HeLa cells in vitro were detected by usingCCK-8 method.Results：The particle size of harmine liposome distributes concentrated.The half inhibitory concentration(IC50)of harmine and that of harmine liposome on Hela cells were 3.83 μg·mL-1and 2.84 μg·mL-1，respectively.Conclusion：The liposome of harmine can increase its activity of anti-cervical carcinoma.

Harmine liposome；Hela cells；cell proliferation

2015-04-23)

*

劉永剛，博士，副教授，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究；E-mail：liuyg0228@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.004