金茵清熱口服液提取工藝比較

鄭江萍，葉方，楊光義，黃良永

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院，湖北 十堰 442000)

·中藥工業·

金茵清熱口服液提取工藝比較

鄭江萍，葉方，楊光義，黃良永*

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院，湖北 十堰 442000)

目的：優選金茵清熱口服液的最佳提取工藝。方法：以綠原酸、梔子苷、總酚酸含量和干浸膏收率為指標進行綜合評價，對金茵清熱口服液的半仿生提取法(SBE)、水提取法(WE)、半仿生提取醇沉法(SBAE)、水提取醇沉法(WAE)4種提取方法進行比較，優選金茵清熱口服液提取的工藝條件。結果：4個指標綜合評價Y值由大到小的順序為Y(SBE)>Y(WE)>Y(SBAE)>Y(WAE)。結論：金茵清熱口服液以SBE法提取最佳。

金茵清熱口服液；提取方法；半仿生提取；綜合評價

金茵清熱口服液是十堰市太和醫院與湖北中醫藥大學聯合開發的中藥口服制劑，其配方是在傳統“茵陳蒿湯”的基礎上加減而成，用于治療急慢性肝炎、淤膽型肝炎、膽囊炎引起的高膽紅素血癥，對多種原因所致的內毒素血癥引起的發熱有明顯效果。金茵清熱口服液主要有效成分如綠原酸、梔子苷、丹酚酸B、大黃素等多為水溶性成分，可以選擇水提醇沉法作為其制備工藝[1]。半仿生提取法(Semi-bionic Extraction，SBE)是對傳統中藥提取方法的改進，根據口服藥物在消化道中要經過不同pH消化液的作用，依次使用不同pH值的酸水和堿水提取單味藥或復方中的有效成分，已證明有更好的提取效果[2-3]。為探討金茵清熱口服液最佳提取效率工藝，特設立4組平行試驗，對水提取法(WE法)、水提取醇沉法(WAE法)、半仿生提取法(SBE)、半仿生提取醇沉法(SBAE)提取效率作比較，旨在為金茵清熱口服液制劑工藝改進提供參考。

1 儀器與材料

戴安UltiMateTM3000型HPLC儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、Chromeleon軟件數據處理系統(美國戴安公司)；TU-1901型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；RE-2000A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；TDL-5A型離心機(德國菲恰爾公司)；FA-2004電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；pHS-25型數顯pH計(上海精密科學儀器有限公司)；CQX25-06型超聲波震蕩器(上海必能信超聲有限公司)。

綠原酸對照品、梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413，110749-201115)；甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 試驗設計

為保證試驗的可比性和可重復性，在飲片規格、煎煮溫度、煎煮溶媒用量、濾過等條件相同的前提下，確定考察的主要指標，然后按照如下制備工藝提取，進行提取方法比較。

2.2 樣品溶液的制備

按處方量稱取金茵清熱口服液處方中藥材粗粉(茵陳15 g、梔子5 g、金銀花7.5 g、連翹5 g、丹參7.5 g、生黃芪10 g、甘草2.5 g)4份，制備如下樣品[1]。

2.2.1 WE提取液 稱取上述藥材粗粉置于圓底燒瓶中，浸泡30 min，加熱回流3次，時間依次為1、0.5、0.5 h，加水量依次為藥材重量的10、6、6倍，提取液用4層紗布濾過，合并濾液，離心(3000 r·min-1)25 min，合并上清液并濃縮至100 mL，制得樣品液A1(每1 mL相當于原飲片0.525 g)，放置冰箱冷藏保存。

2.2.2 WAE提取液 按2.2.1中方法制得樣品溶液，濃縮至100 mL后，加95%的乙醇至醇濃度為60%，放置24 h，離心(3000 r·min-1)10 min，取上清液減壓濃縮至無醇味，加純凈水定容至100 mL，制得樣品液A2(每1 mL相當于原飲片0.525 g)，放置冰箱冷藏保存。

2.2.3 SBE提取液 稱取上述藥材粗粉，置于圓底燒瓶中，浸泡30 min，再按照前期試驗中優選的半仿生提取條件(pH依次為3.0、6.5、8.5，提取時間依次為1、0.5、0.5 h)，加水量依次為藥材重量的10、6、6倍。加熱回流提取3次，提取液用4層紗布濾過，合并濾液，離心(3000 r·min-1)25 min，合并上清液并濃縮至100 mL，制得樣品液A3(每1 mL相當于原飲片0.525 g)，放置冰箱保存。

2.2.4 SBAE提取液 按2.2.3中方法制得樣品溶液，濃縮至100 mL后，加95%的乙醇至醇濃度為60%，放置24 h，離心(3000 r·min-1)10 min，取上清液減壓濃縮至無醇味，加純凈水定容至100 mL，制得樣品液A4(每1 mL相當于原飲片0.525 g)，放置冰箱冷藏保存。

2.3 HPLC法測定綠原酸、梔子苷的含量

2.3.1 色譜條件 Waters SunFireTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，前加Waters Atlantis?T3預柱(20 mm×4.6 mm，3 μm)；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流動相A：0.05%磷酸溶液，流動相B：乙腈，按表1中的規定進行梯度洗脫；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：10 μL[4]。

表1 梯度表

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品(用五氧化二磷減壓干燥12 h)6.00 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得綠原酸對照品儲備液(質量濃度為0.60 mg·mL-1)。精密稱取梔子苷對照品(用五氧化二磷減壓干燥12 h)9.80 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得梔子苷對照品儲備液(質量濃度為0.98 mg·mL-1)。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品溶液A1～A45 mL，分別置100 mL容量瓶中，加甲醇，超聲10 min，放置至室溫后，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，以0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液B1～B4(每1 mL相當于原飲片0.026 g)。

2.3.4 線性關系考察 分別精密量取綠原酸、梔子苷對照品儲備液2.5、1.5、1.0、0.5、0.2、0.1 mL，置5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，在2.3.1色譜條件下，分別自動進樣10 μL，測定峰面積。以峰面積Y為縱坐標，以對照品溶液濃度X(μg·mL-1)為橫坐標，得出標準曲線。得綠原酸回歸方程：Y=164.72X-1.4985，r=0.999 5；梔子苷回歸方程：Y=173.08X-0.114 7，r=0.999 6。表明綠原酸在12～300 μg·mL-1呈良好的線性關系；梔子苷在19.6～490 μg·mL-1呈良好的線性關系。

2.3.5 精密度試驗 取2.3.2的對照品溶液10 μL進樣，重復6次，測定峰面積，計算綠原酸和梔子苷的RSD值分別為1.29%、1.51%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液分別于0、1、2、4、8 h進樣，每次10 μL，測定峰面積，計算綠原酸和梔子苷的RSD值分別為1.76%、1.30%(n=5)，說明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 稱取6份樣品，按供試品B1的制備方法操作，測定含量。測得綠原酸和梔子苷的平均質量分數分別為8.057、3.047 mg·g-1，RSD分別為1.17%、1.09%(n=6)。

2.3.8 加樣回收試驗 按照2.2項下相同的藥材比例，稱取藥材粗粉10.5 g(處方量的1/5)，共6份，置圓底燒瓶中，各按2.2.1藥材的提取方式制備樣品溶液。精密量取制備的樣品溶液5 mL，分別置50 mL容量瓶中，精密加入綠原酸對照品溶液(0.850 mg·mL-1)、梔子苷對照品溶液(0.320 mg·mL-1)各5.0 mL，加甲醇，超聲10 min，放置至室溫后，用甲醇定容至刻度，搖勻，以0.45 μm濾膜過濾，得到供試品溶液，按2.3.1色譜條件進行測定，計算加樣回收率。見表2～3。結果表明該測定方法可行。

表2 綠原酸加樣回收試驗(n=6)

表3 梔子苷加樣回收試驗(n=6)

2.3.9 綠原酸和梔子苷的含量測定 取B1～B4號供試品溶液，每次進樣10 μL，對照品進樣10 μL，記錄綠原酸、梔子苷色譜峰面積，以外標一點法計算含量，結果見圖1、表5。

注：A.對照品；B.供試品；1.綠原酸；2.梔子苷。圖1 綠原酸、梔子苷含量測定色譜圖

2.4 比色法測定總酚酸的含量

2.4.1 對照品溶液的制備 精密量取綠原酸儲備液(0.6 mg·mL-1)5 mL，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，即得綠原酸對照品溶液(質量濃度為0.06 mg·mL-1)。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品溶液A1～A41 mL，分別置25 mL容量瓶中，加50%甲醇，定容，搖勻。精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇，定容，搖勻，即得供試品溶液C1～C4。

2.4.3 顯色試劑的配制 精密稱取十二烷基磺酸鈉3.0 g，加水1000 mL振搖溶解，得0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液；取氯化鐵(FeCl3)1.0 g，加水溶解成100 mL，得1% FeCl3溶液；取鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])0.5 g，加水溶解成100 mL，得0.5%K3[Fe(CN)6]溶液。

2.4.4 測定波長的選擇 精密量取綠原酸對照品溶液、供試品溶液C1和陰性對照(50%甲醇)各2 mL，分別置于25 mL量瓶中，加無水乙醇5 mL，再分別精密加入0.3%十二烷基磺酸鈉溶液2 mL、1% FeCl3-0.5%K3[Fe(CN)6](1∶1)混合溶液2 mL，搖勻，暗處放置5 min，用0.1 mol·L-1鹽酸(HCl)溶液稀釋至25 mL，搖勻，暗處放置20 min。以50%甲醇為空白，分別取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液，在200～800 nm波長范圍內掃描，結果綠原酸對照品溶液和供試品溶液的光譜圖一致，均在710 nm處有最大吸收，陰性對照在此無吸收，故選擇710 nm為測定波長。見圖2。

注：1.供試品溶液；2.對照品溶液；3.陰性對照。圖2 紫外光譜圖

2.4.5 線性關系考察 精密量取綠原酸對照品溶液(0.06 mg·mL-1)8、5、2.5、2、1.5、1.0、0.5 mL，置25 mL容量瓶中，按2.4.4項下方法制備供試品溶液，于710.5 nm處測定吸光度。以對照品含量X(μg·mL-1)為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.050 2X-0.024 9，r=0.999 5。結果表明，綠原酸在1.2～19.2 μg·mL-1呈良好的線性關系。

2.4.6 精密度試驗 取上述綠原酸對照品溶液(9.6 μg·mL-1)2 mL，按2.4.4項下方法，連續測定6次，結果RSD為1.49%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩定性試驗 取2.4.4項下的供試品溶液C1分別于0、1、2、4、6 h測定吸光度，RSD為1.17%(n=5)，說明供試品溶液在6 h內穩定性良好。

2.4.8 重復性試驗 稱取6份樣品，按2.4.2項下制備供試品C1的方法制備供試品溶液，按含量測定方法測定含量，平均質量分數為28.283 mg·g-1，RSD為1.20%(n=6)。

2.4.9 總酚酸加樣回收試驗 同2.3.8項下操作，自“各按2.2.1藥材的提取方式制備樣品溶液”開始，精密量取制備的樣品溶液各1 mL，置25 mL容量瓶中，各精密加入綠原酸對照品溶液(0.60 mg·mL-1)5 mL，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL置25 mL量瓶中，按2.4.4項下方法，制備測定溶液，按含量測定的方法操作，測總酚酸的含量，計算加樣回收率，結果見表4。

表4 總酚酸加樣回收率試驗(n=6)

2.4.10 總酚酸的含量測定 取C1～C4供試品溶液2 mL，按2.4.4項下方法制備測定溶液，在710.5 nm處測定吸光度，代入標準線性方程中計算含量，結果見表5。

2.5 干浸膏得率的測定

精密量取A1～A4號樣品溶液各25 mL，置已烘干恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘2 h，置干燥器內30 min，稱重并計算干浸膏得率，結果見表5。

2.6 試驗結果

表5 各指標成分標準化值及綜合評價值

注：括號內為標準化處理的值。

3 討論

本試驗以4組提取液中綠原酸、梔子苷、總酚酸含量和干浸膏收率為指標進行考察，將結果進行標準化處理，采用設定的加權系數進行綜合評價，得出綜合評價值Y。根據Y值大小評價金茵清熱口服液4種提取方法的提取效果。結果各綜合評價Y值由大到小的順序為Y(SBE)>Y(WE)>Y(SBAE)>Y(WAE)，說明SBE法提取效果最好，其次是WE法。在金茵清熱口服液制備工藝中將提取液進行醇沉以除去雜質，但在除雜的過程中，可能會帶走部分有效成分，所以醇沉后綜合評價值降低，但SBAE法效果較好。

由于金茵清熱口服液原藥材金銀花、茵陳、丹參中均含有綠原酸等水溶性酚酸類成分，梔子中也含有少量綠原酸[7]，根據吸收值的加和性特點，以綠原酸為對照品測定總酚酸的吸光度可以作為總酚酸的含量測定方法，以此考察不同影響因素對制劑中藥效成分整體提取效果具有代表意義。

為防止大黃藥材中結合蒽醌成分受熱過久、溫度過高分解而影響制劑的瀉下效果，在金茵清熱口服液處方制備工藝中采用沸水溫浸提取大黃藥材飲片中有效成分，而在樣品溶液制備時未加入中藥大黃。

[1] 鄭江萍，庹芹，杜士明.金茵清熱口服液的制備及質量標準研究[J].兒科藥學雜志，2013，19(4)：41-45.

[2] 楊光義，葉方，郝新才.半仿生提取法在中藥新藥研究中的應用[J].中國藥師，2010，13(8)：1188-1190.

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ComparativeStudyofExtractingMethodforJinyinQingreOralLiquid

ZHENG Jiangping，YEFang，YANGGuangyi，HUANGLiangyong*

(DepartmentofPharmacy，TaiheHospitalAffiliatedwithHubeiUniversityofMedicine，ShiyanHubei442000，China)

Objective：To optimize the extraction method for Jinyin Qingre Oral Liquid.Methods：The best extraction method for Jinyin Qingre Oral Liquid was chosen through comparing 4 kinds of extractingMethods：semi-bionic extraction(SBE)，water extraction(WE)，semi-bionic extraction and deposition with alcohol(SBAE)，extracting with water and depositing with alcohol(WAE).The dried extract yield and content of chlorogenic acid，geniposide and total phenolic acid were selected as the assessment indexes.Results：The comprehensive evaluation value was as follows：SBE>WE>SBAE>WAE.Conclusion：SBE is the best extracting method for Jinyin Qingre Oral Liquid.

Jinyin Qingre Oral Liquid；extraction method；semi-bionic extraction；comprehensive evaluation

2015-09-07)

*

黃良永，副主任藥師，研究方向：藥品檢驗；Tel：(0719)8801103，E-mail：huangly66@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.017