正交設(shè)計(jì)優(yōu)選蛹草擬青霉中蟲草素和蟲草多糖的提取工藝△

黃婷婷，馬云淑，陽(yáng)丹，王維麗，譚麒冉

(云南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

正交設(shè)計(jì)優(yōu)選蛹草擬青霉中蟲草素和蟲草多糖的提取工藝△

黃婷婷，馬云淑*，陽(yáng)丹，王維麗，譚麒冉

(云南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

目的：采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化蛹草擬青霉菌絲體中蟲草素和蟲草多糖的提取工藝。方法：建立高效液相色譜測(cè)定指標(biāo)成分蟲草素含量的方法，采用正交試驗(yàn)法考察醇濃度、加醇量、提取次數(shù)與時(shí)間的組合3個(gè)因素對(duì)蟲草素乙醇提取率的影響。醇提后殘?jiān)运崛《嗵?，采用苯?濃硫酸比色法在490 nm處測(cè)定蟲草多糖的含量，以單因素法篩選多糖提取工藝。結(jié)果：HPLC色譜條件下精密度的RSD為0.30%，穩(wěn)定性的RSD為1.27%，重復(fù)性的RSD為2.93%。以乙醇濃度為90%，加醇量為10倍量，提取3次，每次1 h蟲草素的提取率最高；而以乙醇濃度為95%，加醇量為6倍量，提取3次，每次1 h提取蟲草素后的殘?jiān)僖运崛?，蟲草多糖得率最高。結(jié)論：所優(yōu)化的提取工藝蟲草素和蟲草多糖提取率均較高，采用的含量測(cè)定方法穩(wěn)定可靠。

蛹草擬青霉菌絲體；正交試驗(yàn)；蟲草素；蟲草多糖；高效液相色譜法

蛹草擬青霉(PaecilomycesmilitarisLiangsp.nov.)是從蛹蟲草Cordycepsmilltaris(ex Fr)Link中分離而得的一種真菌，現(xiàn)多用作蛹蟲草的代用品。梁宗琦[1]通過人工培養(yǎng)的成熟子實(shí)體無(wú)性型菌株的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)結(jié)果，將蛹蟲草無(wú)性型鑒定為擬青霉屬的一種新種。蛹蟲草又稱為北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草、東北蟲草[2]，其主要含有蟲草多糖、蟲草酸(D-甘露醇)、氨基酸、超氧化物歧化酶(SOD)活酶以及蟲草素等核苷類成分[3]。研究發(fā)現(xiàn)，蛹草擬青霉菌絲體中也含有核苷、蟲草素、多糖等多種生物活性物質(zhì)[4]。其中蟲草素具有抑制炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖、遷移、入侵和腫瘤發(fā)生等功能[5]；蟲草多糖具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和腎臟、降血糖、降血脂等藥理作用[6]。目前報(bào)道二者有關(guān)提取技術(shù)的研究對(duì)象大都為蛹蟲草[7-11]，針對(duì)蛹草擬青霉菌絲體中的蟲草素和多糖的提取工藝研究較少。為提高蛹草擬青霉菌絲體的利用率，本文采用乙醇作為提取溶劑，優(yōu)選蛹草擬青霉菌絲體中蟲草素提取工藝，并考察不同正交工藝條件下乙醇提取蟲草素后，菌絲體殘?jiān)兴崛∠x草多糖的提取率。同時(shí)建立HPLC法檢測(cè)蟲草素含量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蟲草多糖含量的方法，為充分合理開發(fā)利用蛹草擬青霉菌絲體提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent1100 Series，四元泵、二極管陣列檢測(cè)器)；WFZ UV-2000紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)；KMDOS-SK250HP超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；電子分析天平(瑞士普利賽斯儀器公司，Xs25A，d=0.00 001 g)；Sartorius BT25S電子稱；HH-s數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司)；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥

蟲草素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：858-200202)；葡聚糖(阿達(dá)瑪斯，批號(hào)：P1054729)；苯酚(汕頭市光華化學(xué)廠，批號(hào)：20030307)；娃哈哈純凈水；無(wú)水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20121105)；濃硫酸(云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20101221)；95%乙醇(食用級(jí))；甲醇(色譜純)。

蛹草擬青霉菌株來(lái)源于云南嵩明，由云南云百草生物有限公司培養(yǎng)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 蛹草擬青霉菌絲體中蟲草素與多糖的提取工藝考察

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用回流提取法，按照表1對(duì)醇濃度、加醇量、提取時(shí)間及次數(shù)的組合3個(gè)因素，按3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察醇提蟲草素的最優(yōu)工藝條件，對(duì)醇提殘?jiān)僖运崛∠x草多糖，考察提取率。

蟲草素提取：精密稱取SM5蛹草擬青霉菌絲體5.00 g，分別置于50 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇，振搖混合后，連接回流冷凝管。圓底燒瓶置于電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸，規(guī)定時(shí)間內(nèi)停止加熱，趁熱抽濾。濾液揮干，稱重，計(jì)算醇提出膏率，并采用HPLC法測(cè)定蟲草素的含量。

蟲草多糖的提?。簩⑸鲜鼋?jīng)乙醇提取蟲草素后的蛹草擬青霉菌絲體殘?jiān)尤?倍量水，熱回流提取3次，每次1 h，提取液過濾，濾液合并，揮干，稱重，計(jì)算水提出膏率，并采用紫外分光光度法(UV)測(cè)定多糖的含量。

表1 因素水平表

2.2 蟲草素的含量測(cè)定

2.2.1 HPLC法色譜條件 色譜柱：Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(14∶86)；流速：1.0 mL·min-1；UV檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述HPLC條件下，蟲草素分離較好，且溶劑峰對(duì)其無(wú)干擾。結(jié)果見圖1。

注：A.空白溶劑；B.蟲草素對(duì)照品；C.蛹草擬青霉菌絲體供試品。圖1 蛹草擬青霉菌絲體供試品及對(duì)照品HPLC圖

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取各正交試驗(yàn)醇提物0.2 g，加入20%的甲醇提取液2 mL，超聲處理90 min，取出，4000 r·min-1離心15 min，用注射器吸取上清，過0.45 μm微孔濾膜，即為供試品溶液[4]。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蟲草素2.06 mg，用20%甲醇定容至10 mL。精密移取溶液2.5 mL置于5 mL容量瓶中，定容，配得質(zhì)量濃度為103 μg·mL-1的蟲草素對(duì)照品溶液。再移取103 μg·mL-1對(duì)照品溶液2.5 mL，定容至5 mL，重復(fù)操作，配成6份系列濃度的對(duì)照品溶液備用。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6份系列濃度的對(duì)照品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣洗脫，并測(cè)定峰面積，以蟲草素對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)作線性圖，求回歸方程：Y=27.550X-14.821，r=1.000 0，在3.22～206 μg·mL-1蟲草素濃度與峰面積有良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述中間濃度(25.75 μg·mL-1)的蟲草素對(duì)照品溶液10 μL，按照2.2.1項(xiàng)下HPLC條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，蟲草素RSD為0.30%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下HPLC條件，測(cè)定蟲草素含量，結(jié)果RSD=2.93%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定蟲草素峰面積，結(jié)果RSD=1.27%。

2.2.8 樣品含量測(cè)定 精密稱取各正交試驗(yàn)醇提物，按2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別精密吸取10 μL，按照2.2.1項(xiàng)下HPLC條件，測(cè)定供試品溶液中蟲草素的含量。

2.3 蟲草多糖含量測(cè)定(苯酚-硫酸法)

2.3.1 供試品溶液制備 對(duì)醇提工藝正交試驗(yàn)殘?jiān)俳?jīng)水提所得的9份浸膏，分別精密稱取0.10 g，加入蒸餾水15 mL，加熱回流2 h后趁熱抽濾，用蒸餾水洗殘?jiān)?，將濾液、洗液合并，定容至25 mL。精密移取定容好的溶液20 mL，置于蒸發(fā)皿中水浴揮干。將揮發(fā)后剩余物用1 mL蒸餾水洗出，溶解，并置于10 mL離心管中，加入5 mL無(wú)水乙醇，混勻，4000 r·min-1離心15 min，棄去上清液。沉淀物加蒸餾水、無(wú)水乙醇，離心過程再重復(fù)2次。取沉淀物用蒸餾水溶解定容至50 mL，作為樣品液備用。吸取2 mL樣品液至20 mL試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混勻，快速加入7 mL濃硫酸，混勻，置于40 ℃水浴30 min，再置于冰水浴5 min，之后快速升至室溫，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定490 nm波長(zhǎng)吸光度。以蒸餾水代替待測(cè)樣品溶液，用同樣方法操作，作為空白對(duì)照[4]。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取分子量為4萬(wàn)的葡聚糖0.050 0 g，定容至50 mL備用。分別取定容好的對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于100 mL容量瓶中定容。按2.3.1項(xiàng)下多糖測(cè)定方法進(jìn)行操作。以蒸餾水為空白，在490 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各對(duì)照品的吸光度。以葡聚糖質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)、吸光度A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=0.010 8X+0.032 9，r=0.999 3，吸光度在0.2～0.7與葡聚糖質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.4結(jié)果

2.4.1 蟲草素的醇提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 2.2.8中測(cè)定所得蟲草素含量見表2，蟲草素的醇提正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析見表3，方差分析見表4～5。

結(jié)果表明，對(duì)醇提出膏率A、B、C因素影響差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，影響程度為A>C>B，即醇濃度>提取時(shí)間與次數(shù)>加醇倍數(shù)，最佳工藝條件為A2B3C3，即乙醇濃度為90%，每次10倍量，提取3次，每次1 h。對(duì)蟲草素提取率A因素即醇濃度影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F0.05B>C，即醇濃度>加醇倍數(shù)>提取時(shí)間與次數(shù)，最佳工藝條件為A2B3C3，因此確定蟲草素提取最佳工藝條件為乙醇濃度為90%，每次10倍量，提取3次，每次1 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 醇提工藝正交試驗(yàn)出膏率與蟲草素含量極差分析

表4 醇提出膏率提取率方差分析

注：“-”表示無(wú)顯著性。下同。

表5 醇提蟲草素工藝提取率方差分析

注：“*”表示F>F0.1。

2.4.2 正交試驗(yàn)后殘?jiān)乃岫嗵堑寐史治?將醇提后的殘?jiān)鼡]干乙醇后用水提取，結(jié)果見表2，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多糖得率極差分析及方差分析，見表6～8。

表6 水提工藝出膏率與多糖得率極差分析

表7 水提工藝出膏率方差分析

表8 多糖提取工藝提取率方差分析

結(jié)果表明，對(duì)水提出膏率A、B、C因素影響差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，影響程度為A>C>B，即醇濃度>提取時(shí)間與次數(shù)>加醇倍數(shù)，最佳工藝條件A2B1C3，即以90%乙醇，提取3次，每次6倍量，提取1 h。對(duì)多糖提取率A、B、C因素影響差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，影響程度為B>A>C，即加醇倍數(shù)>醇濃度>提取時(shí)間與次數(shù)，最佳工藝條件為A1B1C3，即以95%乙醇提取3次，每次6倍量，提取1 h，該條件下提取出來(lái)的蟲草多糖含量較高。

綜合蟲草素與蟲草多糖的提取率試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)醇濃度為90%，每次10倍量，提取3次，每次1 h時(shí)蟲草素提取率高；而以95%乙醇，每次6倍量，提取3次，每次1 h時(shí)蟲草素醇提后的殘?jiān)邢x草多糖得率高。考慮到需在充分提取蟲草素基礎(chǔ)上，再利用殘?jiān)崛≥^多的蟲草多糖，最終優(yōu)選工藝為以90%乙醇，加醇量分別為10、8、6倍，提取3次，每次1 h，殘?jiān)鼡]去乙醇后，分別加10、8倍量水提取2次，每次1.5 h。

2.5 工藝驗(yàn)證

取蛹草擬青霉菌絲體5.00 g，分別用90%乙醇10、8、6倍量提取3次，每次1 h，趁熱過濾，收集乙醇提取液，減壓回收至無(wú)醇味，于40 ℃干燥后備用。將醇提后的藥渣揮至無(wú)醇味，再分別用10、8倍量的水提取2次，每次1.5 h，收集水提取液備用。

分別按2.2、2.3項(xiàng)下方法測(cè)定醇提浸膏中蟲草素含量和水提浸膏中蟲草多糖含量，結(jié)果見表9。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)優(yōu)選方案相比，蟲草素含量接近，蟲草多糖含量相對(duì)降低，穩(wěn)定性較好，表明所選工藝條件穩(wěn)定可行。

表9 工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

本文首先考察了醇濃度、加醇量、提取時(shí)間及次數(shù)的組合3個(gè)因素對(duì)蛹草擬青霉中蟲草素的影響，進(jìn)而考察醇提后殘?jiān)卸嗵翘崛÷?，為同時(shí)提取蟲草素與多糖提供試驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果顯示，乙醇濃度對(duì)菌絲體中蟲草素提取率影響明顯，同時(shí)也影響醇提后菌絲體殘?jiān)兴崛《嗵堑牡寐省Ｓ捎诙嗵遣蝗苡诟邼舛纫掖?，因此?dāng)乙醇濃度為95%時(shí)，殘?jiān)卸嗵堑寐首罡?，但與90%乙醇提取后殘?jiān)卸嗵堑寐什町悷o(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而蟲草素在90%乙醇中提取率最高，綜合考察蟲草素和多糖提取率，最終提取工藝確定為分別用90%乙醇10、8、6倍量提取3次，每次1 h，藥渣揮至無(wú)醇味后，分別用10、8倍量的水提取2次，每次1.5 h。

蟲草素主要溶于水、熱乙醇、甲醇，常用的提取方法有浸提法、超聲法、索氏提取法和回流提取法。本文采用回流提取法提取蛹草擬青霉菌絲體，并建立了蟲草素的HPLC條件。

經(jīng)對(duì)比測(cè)定正交醇提部分和水提部分中蟲草素的含量發(fā)現(xiàn)，先用高濃度的乙醇提取蛹草擬青霉菌絲體，殘?jiān)俳?jīng)水提后，水提部分再測(cè)定蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.99 μg·g-1，含量較低，即高濃度的乙醇可將蛹草擬青霉中的蟲草素基本提取完全。

一般蟲草多糖的提取工藝為水提液經(jīng)適當(dāng)濃縮，再用高濃度乙醇沉淀，得更純的多糖。但本文考慮到水提液中還含有其他有效成分，而蟲草多糖只作為正交工藝考察指標(biāo)，故只將醇提殘?jiān)岷鬂饪s得到水提浸膏，工藝中未涉及到醇沉這一純化步驟。

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StudyonExtractionProcessofCordycepinandCordycepicPolysaccharidesfromMyceliaofPaecilomycesmilitarisbyOrthogonalDesign

HUANG Tingting，MAYunshu*，YANGDan，WANGWeili，TANQiran

(CollegeofPharmacy，YunNanUniversityofTraditionalMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To optimize the extraction processes of cordycepin and cordycepic polysaccharides from mycelia ofPaecilomycesmilitarisby using Orthogonal design.Methods：A HPLC method was established to determine the content of cordycepin which was taken as indexes，and orthogonal test method was used to investigate three factors of alcohol concentration，alcohol volume ratio，and the combination of extraction times with time to influence on the extraction efficiency of cordycepin.Detection was performed at wavelength of 260 nm.The column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL.After extracted by alcohol，the residue of mycelia was dealt with water to extracted cordycepic polysaccharides，and colorimetric method by using phenol—concentrated sulfuric acid as chromogenic agent was used to determine the content of cordycepic polysaccharides in the extract under 490 nm.Results：Under the condition of HPLC，the precision of RSD was 0.30%，the stability of RSD was 1.27% and the RSD of reproducibility was 2.93%.The results showed the extract ratio of cordycepin was the highest with the process parameters of 90% alcohol，10 times of alcohol volume ratio，3 times with 1h for every time.And the water extract ratio of Cordyceps polysaccharide in the mycelia residue was the highest after cordycepin was extracted from mycelia with 95% alcohol，6 times of alcohol volume ratio，3 times，with 1h each time.Conclusion：The extraction efficiency of cordycepin and Cordyceps Polysaccharide was high under the optimum process，and the methods of the content determination were stabile and reliable.

Mycelia ofPaecilomycesmilitaris；orthogonal test；cordycepin；cordycepic polysaccharides；HPLC

2015-05-12)

云南省教育廳科學(xué)研究基金重大專項(xiàng)(00360320700)

*

馬云淑，教授，研究方向：中藥學(xué)；E-mail：yunshuma2@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.018