女貞子中齊墩果酸含量測定及促進葡萄糖消耗體外細胞實驗研究△

孫京海，潘晴，李凌軍，馬魯豫

(1.濟南市婦幼保健院，山東 濟南 250001；2.山東省皮膚病性病防治研究所,山東 濟南 250022；3.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；4.山東省醫學科學院，山東 濟南 250001)

女貞子中齊墩果酸含量測定及促進葡萄糖消耗體外細胞實驗研究△

孫京海1，潘晴2，李凌軍3，馬魯豫4*

(1.濟南市婦幼保健院，山東 濟南250001；2.山東省皮膚病性病防治研究所,山東 濟南250022；3.山東中醫藥大學，山東 濟南250355；4.山東省醫學科學院，山東 濟南250001)

目的：測定10批不同批次女貞子中齊墩果酸含量，并對女貞子醇提物的降血糖作用進行體外細胞實驗研究。方法：用10倍量70%乙醇水溶液提取1h，提取多次，直至最后一次提取液中檢測不到齊墩果酸含量，合并多次提取液，濃縮，通過HPLC法測定10批次不同產地女貞子中齊墩果酸的含量；用人肝癌細胞HepG2細胞來研究女貞子醇提物的降糖作用。結果：不同批次女貞子中齊墩果酸的含量有一定差異，含量不得低于0.50%；不同濃度的女貞子醇提液均有促進細胞消耗葡萄糖的作用，且在一定范圍內隨濃度升高而增強。結論：女貞子藥材的醇提物具有促進葡萄糖消耗的作用，值得進一步研究推廣。

女貞子；齊墩果酸；葡萄糖消耗

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實，其味甘、苦，性涼，歸肝、腎經。其用藥歷史悠久，被《神農本草經》列為上品，有滋補肝腎、明目烏發的功能。現代藥理研究表明女貞子具有保肝、增強免疫、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎抑菌、降血糖、血脂等藥理作用[1-4]。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，高血糖的發病率呈明顯上升趨勢，且逐漸有年輕化趨勢[5]。當血糖值高過規定的水平時就會形成高血糖癥。女貞子具有降血糖的功效，據報道，其藥效成分主要為齊墩果酸[6]。本研究用HPLC測定了10批女貞子中齊墩果酸的含量，用體外細胞實驗的方法研究女貞子提取物的降糖作用。

1 儀器與材料

1.1儀器

D2000日立高效液相色譜儀，KQ-250E型超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)，AE240型電子分析天平(上海市安亭電子儀器廠)，細胞培養板、CO2培養箱(無錫久平儀器有限公司)，超凈工作臺，倒置顯微鏡，酶標儀。

1.2材料

10批女貞子(濟南漱玉平民大藥房)，經山東中醫藥大學李寶國副教授鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實。

齊墩果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：20130416)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，乙醇(95%分析純)，磷酸(分析純)，娃哈哈純凈水，HepG2細胞株(中國科學院細胞生物學研究所)，DMEM低糖培養基、DMEM高糖培養基(上海創賽科學儀器有限公司)，胎牛血清FBS、PBS洗液、胰酶(TrypsinEDTA)、葡萄糖測定試劑盒(南京建成科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1含水量與雜質含量測定

按《中華人民共和國藥典》2010版方法測定10批女貞子藥材的含水量與雜質含量。結果如表1所示。其中山東濟寧產女貞子的含水量最高為8.7%，

表1 10批不同產地女貞子雜質含量與含水量

高于《中華人民共和國藥典》規定的8%，為排除含水量對齊墩果酸含量測定的影響，提取前均將藥材烘干至恒重。雜質含量符合《中華人民共和國藥典》規定的不超過3%。

2.2含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-乙腈-水-磷酸(50∶40∶10∶0.03)為流動相；紫外檢測器檢測；檢測波長為210nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1。齊墩果酸對照品及女貞子樣品色譜圖見圖1。

注：A.齊墩果酸對照品；B.女貞子樣品。圖1 齊墩果酸對照品及女貞子樣品色譜圖

2.2.2繪制標準曲線 精密稱定干燥至恒重的齊墩果酸對照品16.33mg，加入乙醇(分析純)定容至10mL容量瓶中，分別進樣1、5、10、15、20、30μL，按照2.2.1中色譜條件測定，以峰面積A(Y)對齊墩果酸質量m(X)進行線性回歸，得到回歸方程Y=5×108X+2.9×105，r=0.9996(n=6)，線性范圍為1.633～48.99μg。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的女貞子藥材粉末(過40目篩)5g，用70%乙醇水溶液浸泡30min后，10倍量70%乙醇水溶液提取1h，提取多次，直至提取液中檢測不出齊墩果酸，合并提取液濃縮，蒸干，用乙醇(95%分析純)定容至100mL容量瓶。

2.2.4精密度試驗 分別精密吸取線性范圍內高、中、低3種不同濃度的對照品溶液20μL，按上述色譜條件重復進樣5次，測得峰面積的RSD值，分別為0.07%、0.40%、0.43%，說明儀器精密度良好。

2.2.5重復性試驗 取同一批次供試品6份，按相同的方法制備供試品溶液，分別吸取20μL進樣，測定齊墩果酸的含量，計算RSD=4.027%，說明該方法重復性良好。

2.2.6回收率試驗 取線性范圍內已知含量的供試品6份，每份分別精密加入高、中、低3種劑量的對照品，按供試液制備方法制備，測定女貞子中齊墩果酸的含量，計算平均回收率以及RSD值。結果如表2所示。

表2 女貞子中齊墩果酸回收率試驗

2.2.7 樣品的測定 取上述10批女貞子藥材，按2.2.3項下制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，進樣測定樣品中齊墩果酸含量，每批藥材平行試驗2次，結果取均值，見表3。

表3 10批女貞子中齊墩果酸含量(n=2)

3 齊墩果酸促進葡萄糖消耗作用研究

肝臟是人體內物質的代謝中心，在糖代謝的過程中也起著至關重要的作用，它既是利用葡萄糖又是產生葡萄糖的主要器官。人肝癌細胞HepG2細胞雖然是一種癌細胞，但它起源于肝臟并且基本具有正常肝細胞的生物特性，所含的生物轉化代謝酶與人正常肝細胞具有同源性，分化程度較高，并且保留了較完整且活性穩定的生物轉化代謝酶[7-8]。故本研究用人肝癌細胞HepG2細胞來研究齊墩果酸的促進葡萄糖消耗作用。

3.1細胞培養

將經復蘇的HepG2細胞用含10%FBS的DMEM培養基，于5%CO2、37℃環境下進行培養，48h更換一次培養液。待細胞貼壁生長達80%后開始傳代培養，每隔2d傳代1次，用于實驗。

3.2細胞實驗及結果

當細胞生長至一定濃度后，將DMEM低糖培養基換成DMEM高糖培養基。培養24h以后，取生長狀況較好的細胞，用PBS洗液清洗，經胰酶消化懸浮后接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液100μL，先用移液槍將吹打均勻的細胞吸起來，然后槍頭緊貼孔的一側壁(槍頭勿接觸孔底)，緩緩地把細胞注入，每孔復6孔，MTT法測定細胞數量。待細胞充分貼壁后，棄去原來的培養基，每孔加入200μL高糖的DMEM培養基。實驗設置7組，5個加藥組，藥物質量濃度分別為100、200、300、400、500μg·mL-1，1個空白對照組，1個含1μg·mL-1二甲雙胍的陽性藥對照組。培養24h后，用葡萄糖試劑盒測定培養液中葡萄糖含量。空白孔的含糖量減去接種細胞孔的含糖量，即各孔細胞的葡萄糖消耗量(GC)。各組細胞的葡萄糖攝取率情況如圖2所示。

圖2 各組細胞葡萄糖攝取率

由結果可知，不同質量濃度的女貞子提取液均有促進細胞消耗葡萄糖的作用，300μg·mL-1組的降糖效果接近二甲雙胍組，加藥組開始隨著加藥量的增加，降糖效果增強，增加到一定程度后，降糖效果增加的不顯著，反倒開始減弱。

HepG2細胞葡萄糖消耗試驗結束后，加入20μL5g·L-1的MTT，繼續培養4h，棄去培養液，加入DMSO與細胞混勻，震蕩5～10min，用酶標儀于570nm處測光密度度值，用光密度值來反映細胞的生長狀況。結果顯示，空白對照組細胞生長速度最快；女貞子粗提物加藥組，起初隨著濃度增加細胞增長速度加快，直至濃度300μg·mL-1，此后隨著加藥濃度增加，細胞增殖速度減緩，但是不明顯，由此可知女貞子粗提物并沒有明顯的細胞毒性；二甲雙胍組的細胞生長情況與400μg·mL-1女貞子粗提物加藥組相似。

4 討論

女貞子的醇提物具有一定的降糖功效，其主要藥效成分為齊墩果酸，本研究探討了10批不同產地女貞子的齊墩果酸的含量情況，可將齊墩果酸含量作為女貞子藥材新的質量標準的補充，并通過人肝癌細胞HepG2細胞的體外細胞實驗來驗證女貞子醇提物的降糖功效。體外細胞實驗是體外藥理學一種理想的研究方法，具有周期短、易操作、便于檢測等優點。本研究采用的人肝癌細胞HepG2細胞，具有正常肝細胞的生物學特性，廣泛地用于藥理實驗研究，也是研究降血糖作用的常用菌株。當前，隨著人們生活水平提高，高血糖患者逐年增加，開發降糖、不良反應小的新藥變得尤為重要。

[1] 劉亭亭，王萌.女貞子化學成分與藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(14)：228-234.

[2] 張金玲，王小虎，鄧振濤，等.中藥女貞子的化學成分及藥理作用研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2013，22(36)：4100-4101.

[3] 楊曦，蔣桂華.女貞子的研究開發現狀與展望[J].時珍國醫國藥，2008，19(12)：2987-2990.

[4] 黃新蘋，王武朝.中藥女貞子的化學成分研究進展[J].國際藥學研究雜志，2011，38(1)：47-51.

[5] 何玲，王佐偉.3239人體檢高血壓、高血糖、高血脂情況調查分析[J].當代醫學，2013，19(2)：8-10.

[6] 謝靈璞.齊墩果酸對高血糖大鼠胰島素及肝糖原含量的影響[J].中華中醫藥學刊，2012，30(7)：1669-1670，1711.

[7] 張紅芝.翻白草降糖作用及對肝細胞糖代謝影響的研究[D].北京：中國農業大學，2005.

[8] 陳秋，夏永鵬，邱宗蔭.胰島素耐受的HepG2細胞模型建立[J].細胞生物學雜志，2005，27(3)：334-338.

DeterminationofContentOleanolicAcidinLigustriLucidiFructusbyHPLCandItsEffectonPromotingtheGlucoseConsumptioninvitro

SUNJinghai1，PANQing2，LILingjun3，MALuyu4*

(1.JinanMaternalandChildCareHospital，Jinan250001，China;2.ShandongProvincialInstituteofDermtovenereology,Jinan250022，China；3.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；4.Shandongacademyofmedicalsciences，Jinan250001，China)

Objective：To measure the content of oleanolic acid in10different batches of Ligustri lucidi Fructus and study the hypoglycemic effect of the ethanol extract of Ligustri lucidi Fructusinvitro.Methods：Ligustri lucidi Fructus were extracted by10folds of70% ethanol,1h a time, and extracted several times until oleanolic acid was undetectable, the extracts were then merged and enriched. The content of oleanolic acid was determined by HPLC. The hypoglycemic effect of the ethanol extract of Ligustri lucidi Fructus was studied by human liver cancer cell HepG2cells.Results：The content of oleanolic acid of the different batches of Ligustri lucidi Fructus varied and was above0.50%. Different concentrations of extract showed the effect of promoting cells to use glucose, and the effect increased with the concentration within a certain scope.Conclusion：The ethanol extract of Ligustri lucidi Fructus has the effect of promoting the glucose consumption, it deserves for further study .

Ligustri lucidi Fructus; Oleanolic acid; glucose consumption

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.013

2015-04-19)

“十二五”重大新藥創制國家科技重大專項(2013ZX09103002-005)

*

馬魯豫，副研究員，研究方向：中藥新藥開發；E-mail：maluyuyky@126.com