白簕提取物抑制痤瘡丙酸桿菌及美白活性研究

勞景輝，潘超美，喻勤，倪慶桂，孫忠偉，郁曉藝

[1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006；2.完美(中國)有限公司，廣東 中山 528402]

白簕提取物抑制痤瘡丙酸桿菌及美白活性研究

勞景輝1，2，潘超美1*，喻勤2，倪慶桂2，孫忠偉2，郁曉藝2

[1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州510006；2.完美(中國)有限公司，廣東 中山528402]

目的：對白簕提取物的抑制痤瘡丙酸桿菌和美白活性進行研究，評價白簕提取物的生物活性強弱。方法：以測定最小抑菌濃度(MIC)來評價白簕提取物抑制痤瘡丙酸桿菌生長的活性；以抑制B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶能力，測定其美白活性。結果：白簕醇提物和水提物抑制痤瘡丙酸桿菌的MIC值分別為2.5mg·mL-1和5mg·mL-1；白簕水提物對酪氨酸酶抑制活性較好，但醇提物未發現該活性。結論：白簕醇提物具有良好的抑制痤瘡丙酸桿菌活性，而水提物的活性則表現在抑制酪氨酸酶中。

白簕；提取物；抑制痤瘡丙酸桿菌；美白活性

白簕Eleutherococcustrifoliatus(Linnaeus) S.Y.Hu又名三加皮、刺三加和三葉五加等，為五加科(Araliaceae A.L.Jussieu)五加屬(EleutherococcusMaxim)攀援狀灌木，廣泛分布于我國貴州、四川、廣西、廣東、臺灣和海南等南方省份以及泰國、越南和馬來西亞等東南亞國家。在廣東省江門地區，人們廣泛應用白簕作為止癢清毒的民間草藥已有很長的歷史[1]，而在實驗研究中也發現，白簕具有顯著的抗炎抑菌活性[2-3]，這提示白簕可能有較好的消腫止癢功效，如抗痤瘡等。為了進一步發掘白簕的新功能和活性，本實驗以白簕水提物和醇提物為實驗材料，分別測定其對痤瘡丙酸桿菌的MIC(最小抑菌濃度)值，確定白簕對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果，推測其抗痤瘡活性；同時以小鼠B16黑色素瘤細胞為受試細胞，分別測定白簕醇提物和水提物對細胞內酪氨酸酶的抑制效果，探討白簕對B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性的影響，初步確定白簕的體外美白活性。

1 材料

1.1實驗菌株及細胞株

痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes，廣東省微生物研究所，編號：ATCC11827)；小鼠B16黑色素瘤細胞株(中國科學院上海細胞庫)。

1.2材料與試劑

實驗材料：白簕采自廣東省恩平雪壯白簕基地，經廣州中醫藥大學藥用植物學教研室主任潘超美教授鑒定為五加科植物白簕Eleutherococcustrifoliatus(Linnaeus) S.Y.Hu的莖和葉。

改良GAM瓊脂基礎(北京陸橋技術有限公司，批號：1301082)；改良GAM肉湯(珠海維特生物技術有限公司，批號：20121229)；RPMI-1640培養基(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；胎牛血清(Gibco/Life Technologies)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco/Life Technologies)；DMSO(細胞級，Sigma-Aldrich公司)；L-多巴(Sigma公司)；熊果苷(Sigma公司)；Triton X-100(Sigma公司)；水為超純水，其余試劑為分析純。

1.3儀器與設備

SHIMADZUUV-2550紫外可見分光光度儀[島津(香港)有限公司]；ESCO/AC2-S生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司)；CH2-TKC-3倒置顯微鏡(廣東光學儀器有限公司)；2406型細胞培養箱(美國SHELLAB公司)；InfiniteF200型多功能酶標儀(奧地利TECAN公司)；Eppendorf移液槍、Bio-DL排槍和CorningIncorporated/Nest細胞耗材等。

2 方法

2.1藥材預處理及提取物制備

采集新鮮白簕，取用頂端幼嫩莖葉部分，洗凈，陰干后置于烘箱干燥過夜。粉碎干燥后的白簕，過10目篩，備用。醇提物制備：稱取干燥粉碎后的白簕300g，置于圓底燒瓶中，加入10倍量(W/V)95%乙醇回流提取2次，每次1.5h，濾過(180目篩)，合并濾液。減壓濃縮(60℃)，約1.5h/次，合并多次濃縮液后，再統一濃縮約2h，濃縮浸膏供真空干燥用。將上述濃縮浸膏傾倒于托盤內，真空干燥約10h(55℃，真空度≥-0.1MPa)。將托盤內提取物刮下，研碎，過80目篩。水提物制備：稱量干燥粉碎后的白簕300g，置于圓底燒瓶中，加入12倍量(W/W)水，回流提取2次，每次1.5h，濾過(180目篩)，合并濾液。采用噴霧干燥方式直接噴干。

2.2測定白簕提取物抑制痤瘡丙酸桿菌的MIC值

2.2.1樣品溶液的制備 分別稱取白簕水提物和醇提物。用無菌水溶解，各配得0.1g·mL-1(生藥濃度)100mL溶液。用無菌濾膜分別將溶液過濾除菌，濾液待用。

2.2.2菌種活化 將痤瘡丙酸桿菌轉接到改良GAM瓊脂上，37℃厭氧培養2d，使菌活化繁殖。

2.2.3菌懸液的制備 用接種環挑取痤瘡丙酸桿菌菌體，放入100mL無菌水中，充分振蕩10min，制成菌體懸液。將菌懸液倒入比色杯中，選用600nm波長，以無菌水作為空白對照，采用比濁法測定菌懸液的濃度，調整菌懸液濃度使每次所用菌懸液濃度基本保持一致。

2.2.4MIC值的測定 在滅菌后的改良GAM肉湯中分別加入等體積無菌水、雙抗和已過濾除菌的樣品溶液，作為陰性對照、陽性對照和實驗組，其中實驗組各試管的藥液濃度按生藥量算，見表1。分別接入已多次活化的等量菌懸液，密封，編號，37℃下靜置培養48h，取樣測定培養基的吸光度(OD)值(600nm波長)，并以不接入菌懸液的作為實驗對照組，得出最小抑菌濃度(MIC)。

表1 抑制痤瘡丙酸桿菌實驗各組試管組成及加入量

表1(續)

注：各管分別做3個重復；2號及14～23號管不加入菌液，其余各管加入等量菌液。

2.3白簕提取物對B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性的影響2.3.1 樣品溶液的制備 同2.1。再將醇提物溶液和水提物溶液用RPMI-1640液體培養基分別稀釋成10、8、6、4、2 mg·mL-1的生藥濃度。

2.3.2 小鼠B16黑色素瘤細胞的培養 在無菌條件下，將1105個·mL-1的小鼠B16黑色素瘤細胞接種于含RPMI-1640液體培養基的培養皿中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3 d用0.25 %胰酶消化傳代1次。

2.3.3 測定白簕提取物對B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性抑制率 取對數生長期的黑色素瘤B16細胞，將細胞懸液調整至細胞濃度為2×104個·mL-1后，接種于96孔培養板，每孔180 μL。實驗設置空白對照組、陰性對照組和實驗組。種板時，空白對照組只加細胞培養液、其他組都加細胞懸液。在5% CO2、37 ℃孵育24 h，待細胞貼壁后，分別加入20 μL上述不同濃度的醇提物溶液和水提物溶液，每個濃度設3個重復，使終濃度為加入時的1/10，培養72 h。棄培養基，用磷酸緩沖液(PBS)潤洗2次，每孔加入1% TritonX-100溶液100 μL，迅速放入-80 ℃低溫冰箱凍存30 min。室溫下融化使得細胞完全破裂。37 ℃預溫后加入1%左旋多巴溶液(用PBS稀釋，使其pH<7)20 μL，37 ℃反應2 h后，測定490 nm處吸光度值。以終濃度為200 μg·mL-1的熊果苷為陽性對照，培養液為陰性和空白對照[4-5]。

酪氨酸酶活性抑制率=[(陰性對照組平均吸光度值-實驗組平均吸光度值)/(陰性對照組平均吸光度值-空白對照組平均吸光度值)]×100

3 結果與分析

3.1白簕醇提物抑制痤瘡丙酸桿菌的MIC值

由表2、3可知，白簕醇提物在生藥濃度為10、5、2.5 mg·mL-1時，其菌體OD600的吸光度與陰性對照組相比，均有統計學差異，表明在這些濃度下，醇提物具有較好的抑菌效果，而在生藥濃度為1.25 mg·mL-1時，其菌體OD600的吸光度與陰性對照組相比，P>0.05，表明該濃度下，藥物的抑菌能力下降，與陰性對照組的差異無統計學意義，所以白簕醇提物抑制痤瘡丙酸桿菌的MIC值為生藥濃度2.5 mg·mL-1。另外，在進行預實驗時，由于樣品的顏色較深，對測定吸光度有較大影響，因此，在正式實驗中，除了醇提物和水提物實驗組外，還增加了相應的實驗對照組，主要用于排除樣品本身對測定的影響，使實驗結果更準確。

表2 陰性組、空白組和陽性組的

注：(1)菌體OD600是指扣除空白對照，即菌體的吸光度；(2)與陰性組相比較，*P<0.05，下同。

表3 白簕醇提物實驗組的

注：菌體OD600是指扣除醇提物實驗對照，即菌體的吸光度。

3.2白簕水提物抑制痤瘡丙酸桿菌的MIC值

由表4可知，白簕水提物也有較好的抑菌效果，在生藥濃度為5mg·mL-1時，其抑菌效果較好，菌體OD600與陰性組比較，有統計學差異，但在5mg·mL-1以下的濃度，則沒有明顯的抑菌效果，因此，白簕水提物抑制痤瘡丙酸桿菌的MIC值為生藥濃度5mg·mL-1。

表4 白簕水提物實驗組的

注：菌體OD600是指扣除水提物實驗對照，即菌體的吸光度。

3.3白簕醇提物在B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性抑制率 白簕醇提物在本實驗中，未發現有酪氨酸酶抑制活性，可能各提取部位中所含的活性成分對不同活性作用效果有差異，在后續研究中將繼續進行探討。

3.4白簕水提物在B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性抑制率 結果見表5。實驗發現，白簕水提物具有較好的酪氨酸酶抑制活性，其抑制效果隨作用濃度的增大而增強，顯示出一定的劑量依賴性，在生藥質量濃度為800 μg·mL-1(即提取物質量濃度約為225.36 μg·mL-1)時，其酪氨酸酶抑制率與200 μg·mL-1熊果苷對照組相當。

表5 白簕水提物對B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性抑制率

注：水提物實驗組的終濃度按生藥量計算。

4 討論

對于白簕抗痤瘡的研究不多，僅有報道白簕對同為皮膚常見菌——金黃色釀膿葡萄球菌的抑制作用，利用濾紙片法測得白簕甲醇提取物對該菌的抑菌圈為11.5mm，與香菇草和鐵包金等抑菌活性相當[6]，但未見白簕對痤瘡丙酸桿菌的抑制研究報道，由于痤瘡丙酸桿菌是痤瘡發病的重要誘因之一，因此，對其的抑制研究更有利于白簕抗痤瘡功效的評估。

另外，具有清熱解毒、與白簕有類似功效的其他中藥，如黃芩和金銀花等，也有對痤瘡丙酸桿菌的抑制研究報道。鄭景峰[7]報道其測得黃芩與黃柏的水提物對痤瘡丙酸桿菌的MIC值為0.3125mg·mL-1和0.625mg·mL-1，與本研究測得白簕水提物的MIC值1.409mg·mL-1(折算同為提取物濃度比較)要低，與白簕醇提物的MIC值0.439mg·mL-1(折算同為提取物濃度比較)相當；但朱亞芳等[8]報道黃芩和金銀花的水提物MIC值為12.50mg·mL-1(生藥濃度)則比本研究的水提物MIC值要高，即抑菌活性較白簕差。出現這種同種藥材活性報道差異的原因可能有幾個方面：第一，藥材的質量差異，雖然是同種藥材，如黃芩，來源不同其含有的活性成分差異也會相差很大，導致藥效出現差異；第二，實驗菌株的差異，同一個種的菌，其菌株不同，所表現出來的活力也會不同，朱亞芳等使用的是ATCC11827，而鄭景峰使用的是BCRC10723，因此，應對具體的研究展開分析。通過這些對比可得，白簕醇提物的抑制痤瘡丙酸桿菌效果較好，可能是由于其富含黃酮和多酚類物質，有利于抑制細菌的生長。

目前評價美白化妝品原料的功效，主要是以對酪氨酸酶活性的抑制效果作為主要指標。本研究以小鼠黑色素瘤B16細胞為受試細胞，測定白簕醇提物與水提物對其酪氨酸酶活性的影響，發現白簕水提物具有較好的抑制酪氨酸酶活性，而醇提物卻未發現該活性，這與許多研究中植物的美白活性成分分布于醇提物中不一致[9-10]，這可能是白簕的美白活性成分與其他植物的不同，在白簕水提物中，含有多糖和蛋白等非醇溶性物質，這些都可能是白簕的美白活性成分，如銀耳中的水溶性部分含有的多糖就被證實有良好的美白活性。另外，也有部分常見的美白中藥，其水提物也有報道具有較好美白活性，白蘞、白芷和白及水提物抑制酪氨酸酶活性明顯高于醇提物，且水提物的半數抑制濃度分別為0.35、3.80、3.89mg·mL-1 [11]，與白簕水提物相比，當抑制率為57.82%時，白簕水提物對應的用藥濃度僅為800μg·mL-1，遠低于被廣泛研究的美白中藥白芷，表明白簕水提物比白芷的抑制酪氨酸酶活性更強[12-13]，具有良好的美白活性。由于目前對白簕的美白活性研究鮮有報道，因此，后續還需要對白簕水提物的美白活性進行深入研究，如對黑色素合成的影響等，了解其美白作用機理，進一步篩選出美白活性成分，為高效利用這一藥用資源提供實驗依據。

綜上所述，白簕有良好的抑制痤瘡丙酸桿菌及抑制酪氨酸酶活性，其提取物可開發為祛痤瘡產品和美白產品的原料。

[1] 陳小菊.簕菜療法在新生兒濕疹治療中的應用和護理成效[J].實用醫學雜志，2006，22(13)：1587-1588.

[2] 肖杭，黎云祥，蔡凌云，等.白簕葉總黃酮的提取和純化及其抑菌試驗初探[J].光譜實驗室，2010，27(6)：2130-2134.

[3]AbdulHamidR，TeohHK，OthmanF.Anti-inflammatoryandanti-hyperalgesicactivitiesofAcanthopanaxtrifoliatus(L) Merr leaves[J].Pharmacogn Res，2013，5(2)：129-133..

[4] 鄭爽.松茸液體發酵產物的美白作用的研究[D].長春：吉林農業大學，2014：31.

[5] 王鵬.植物美白提取物的篩選及作用機理探索[D].天津：天津商業大學，2010：20.

[6] Huang C，Lee C，Chen L，et al.Antimicrobial herbs againstStaphylococcucaureusaandPropionibacteriumacnes[J].Planta Med，2010，76：P500.

[7] 鄭景峰.六十種中藥材熱水萃出物對痤瘡病原菌之抑菌性[D].臺灣：臺灣大同大學，2005：73-74.

[8] 朱亞芳，趙浩如.中藥體外抑制痤瘡丙酸桿菌的活性測定[J].藥學與臨床研究，2009，17(3)：224-226.

[9] 郭媛媛，趙駿.植物藥及其組方美白作用的研究[J].江西中醫學院學報，2008，20(4)：65-66.

[10] 劉暢，莫思穎，張怡，等.20種植物醇提物美白作用的體外測試[J].日用化學工業，2013，43(6)：450-452.

[11] 唐海誼，何冠邦，周喜林.美白中藥之水及乙醇提取物對酪氨酸酶抑制功效之比較[J].中國藥學雜志，2005，40(5)：342-343.

[12] 歐喜燕，于秀華.白芷美白液體外抑制酪氨酸酶活性的實驗研究[J].長春中醫藥大學學報，2012，28(6)：960-961.

[13] 高彤彤，許云，晏志勇.不同濃度白芷美白液對人體酪氨酸酶活性抑制情況分析[J].中藥材，2015，38(2)：376-378.

StudyonAntimicrobialActivityAgainstPropionibacteriumAcnesandWhiteningEffectofExtractofEleutherococcusTrifoliatusinVitro

LAOJinghui1，2，PANChaomei1*，YUQin2，NIQinggui2，SunZhongwei2，YuXiaoyi2

[1.GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China;2.Perfect(China)Co.，Ltd.，Zhongshan528402，China]

Objective：Antimicrobial activity againstPropionibacteriumacnesand whitening effect of extract ofEleutherococcustrifoliatuswere studied to assay the bioactivities.Methods：Antimicrobial activity againstP.acneswas evaluated by MIC.Whitening effect was tested by the tyrosinase inhibitory activity in B16cell.Results：The MIC of ethanol extract and water extract were2.5mg·mL-1，5mg·mL-1，respectively.Water extract had good tyrosinase inhibitory activity，while ethanol extract showed no effect.Conclusion：Ethanol extract had stronger activity than water extract in antimicrobial againstP.acnes，but water extract had good tryosinase inhibitory activity.

Eleutherococcustrifoliatus；extract；antimicrobial activity；whitening effect

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.008

2015-09-23)

*

潘超美，教授，研究方向：藥用植物資源的開發利用；E-mail：pancm@gzucm.edu.cn