地龍抗呼吸道合胞病毒的有效部位篩選△

張加澤，任瑩，王清，候寶山，牛文斐，姜愛雯，周長征*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.河北北方學院 附屬第一醫院，河北 張家口 075000)

地龍抗呼吸道合胞病毒的有效部位篩選△

張加澤1，任瑩1，王清1，候寶山1，牛文斐1，姜愛雯2，周長征1*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南250355；2.河北北方學院 附屬第一醫院，河北 張家口075000)

目的：研究地龍不同極性的粗提取物經純化分離后對呼吸道合胞病毒(RSV)的體外抗病毒活性，從而確定抗病毒的有效部位。方法：預實驗依次用乙酸乙酯、95%乙醇水溶液、水作為溶劑提取藥物，采用RSV-Hep-2細胞感染模型，初步檢測地龍的體外抗RSV活性。依據預實驗的結果，分別采用水提醇沉法和醇提水沉法對粗提取物進一步地分離和純化，將處理后的上清液和沉淀物分別進行體外抗病毒實驗。然后根據實驗結果將醇提水沉后的沉淀過大孔樹脂DM130，分別用25%、50%、75%的乙醇水溶液洗脫，將洗脫液濃縮后做抗病毒實驗，在顯微鏡下觀察細胞的病變，用酶標儀測定中性紅染色A540值，計算其治療指數。結果：乙酸乙酯、乙醇、水3種粗提取物中水粗提取物對呼吸道合胞病毒的抑制效果最好，TI=74.21。將粗提取液水提醇沉或醇提水沉后發現醇提水沉的沉淀對呼吸道合胞病毒的抑制效果最好，TI=107.11。將地龍醇提水沉的沉淀過大孔樹脂DM130發現75%乙醇2號水溶液沖洗的洗脫液抑制呼吸道合胞病毒的效果最好，TI=63.05.結論：地龍的醇溶性成分對RSV病毒具有明顯的抑制作用。

地龍；粗提取物；水提醇沉；醇提水沉；大孔樹脂；抗呼吸道合胞病毒

地龍，又稱為蚯蚓、歌女、廣地龍、曲蟮等，雌雄同體，始載于《神農本草經》，屬于環節動物門。地龍為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗環毛蝴PheretimavulgarisChen、威廉環宅頓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或柿盲環毛蝴PheretimapectiniferaMkhaeken的干燥體。其性寒、味咸，歸肝、脾、膀胱經。具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功能。用于高熱神昏，驚癇抽搐，關節痹痛，肢體麻木，半身不遂，肺熱喘咳，水腫尿少[1]。地龍在我國作為藥物在臨床上使用已經有數千年的歷史[2]。目前還沒有關于地龍抗呼吸道合胞病毒的報道。本實驗采用不同極性的溶劑分別提取地龍，然后采用醇提水沉法、水提醇沉法、大孔樹脂吸附法進一步純化分離，采用RSV-Hep-2體外病毒感染模型研究了地龍對呼吸道合胞病毒的體外抑制作用，為篩選出抗RSV的單體做前期準備。

1 材料與儀器

1.1儀器

TD5M型高速臺式離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；超凈工作臺(上海力申科學儀器有限公司)；酶標儀(Labsystems公司)；熒光倒置顯微鏡(日本奧林帕斯公司)；高壓滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；隔水式二氧化碳培養箱(美國Forma公司)；微量移液器(法國GILSON公司)；725型超低溫冰柜(-80℃，ThermoForma公司)；低溫冰柜(-40℃，三洋公司)；CNX-31倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2病毒株與細胞株

呼吸道合胞病毒(中國疾病預防控制中心病毒研究所流感病毒研究室)；Hep-2細胞(山東省醫學科學院基礎醫學院研究所微生物室)。

1.3試劑與藥品

地龍(購自濟南建聯中藥店)，1640細胞培養液(美國GIBCO產品，含10%牛血清)；1640細胞維持液(美國GIBCO產品，含2%牛血清)；中性紅染液；中性紅脫色液；乙酸乙酯(分析純)；工業乙醇；pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS，含NaCl8g、KCI0.2g、KH2P040.2g、Na2HP042.9g，加三蒸水至1000mL，過濾除菌，分裝，置4℃備用)；蒸餾水；MEM培養基(GIBCO公司)；利巴韋林(100mg·mL-1，山東魯抗醫藥集團有限公司)。

2方法

2.1粗提取物的制備

水總提取物的制備：將50g地龍加水煎煮提取兩次(第一次加10倍水煎煮2h，第二次加8倍水煎煮1.5h)，將粗提液合并后趁熱抽濾，減壓濃縮至50mL(1g·mL-1)，裝入EP管中貼標簽備用。

95%乙醇總提取物的制備：將地龍30g用95%的乙醇回流提取兩次(第一次加10倍量乙醇回流2h，第二次加8倍量乙醇回流1.5h)，把粗提液合并后趁熱抽濾，減壓回收乙醇，得濃縮液30mL(1g·mL-1)，裝入EP管中貼標簽備用。

乙酸乙酯總提取物的制備：地龍20g，用乙酸乙酯回流提取兩次(第一次加10倍量乙酸乙酯回流1.5h，第二次加8倍量乙酸乙酯回流1.5h)。將兩次粗提液合并后抽濾，減壓回收乙酸乙酯得濃縮液20mL(1g·mL-1)，裝入EP管中貼標簽備用。

2.2水提醇沉法和醇提水沉法純化

水提醇沉法：將30g地龍加水煎煮兩次(10倍水，8倍水，每次2h)，將兩次粗提液合并后趁熱抽濾，水浴濃縮至1∶1[3]，向濃縮液中緩慢加入95%乙醇水溶液，并快速攪拌，直至含醇量達到70%，然后靜置24h[4]，過濾，濾液減壓回收乙醇至質量濃度為1g·mL-1，裝入EP管中貼標簽A備用。濾餅用蒸餾水溶解后水浴濃縮至1g·mL-1[5]，裝入EP管中貼標簽B備用。

醇提水沉法：將20g地龍用95%乙醇水溶液回流提取兩次(8倍量乙醇，每次2h)，合并粗提液后抽濾，減壓回收乙醇得濃縮液20mL(1g·mL-1)，向濃縮液中緩緩加入等體積的蒸餾水，并快速攪拌，使含醇量達到50%后靜置冷藏24h，過濾，濾液水浴濃縮至1∶1，保存至EP管中貼標簽C備用。濾餅用乙醇溶解，水浴濃縮至1g·mL-1，裝入EP管中貼標簽D備用。

根據實驗結果將醇提水沉的沉淀用大孔樹脂DM130吸附進一步篩選地龍抗呼吸道合胞病毒的有效部位。

2.3大孔樹脂吸附

大孔樹脂DM130的預處理：取大孔樹脂DM130200g，用95%乙醇水溶液浸泡24h后采用濕法裝柱。首先將大孔樹脂加入到色譜柱中，并不斷敲打色譜柱使大孔樹脂緊密均勻，然后用蒸餾水沖洗，直到洗出液沒有醇味為止，加入5%HCl水溶液浸泡3h，然后用蒸餾水沖洗，直到洗出液為中性為止。再加入5%NaOH水溶液浸泡3h后用蒸餾水沖洗，直到洗出液為中性為止，密封備用。

上樣：將地龍醇提水沉的沉淀用乙醇溶解濃縮后用玻璃棒緩慢上樣在上述備用的大孔樹脂柱中，然后打開閥門，使藥液下降至剛剛沒過樹脂，待藥液吸附0.5h后，依次用25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇水溶液進行洗脫，流速為3BV·h-1，每個濃度梯度洗脫時，每200mL接一瓶，直到流出液沒有顏色為止。然后將每個柱體積編號如1水，2水，25%醇1號等。

體外抗病毒實驗：把液氮凍存的Hep-2細胞立刻放入37℃的水浴中，不停晃動細胞瓶使其快速融化并懸浮于培養液中，然后將細胞培養瓶放在37℃、5%CO2條件下靜置培養，細胞3d后會長成單層，再用0.25%胰酶消化，然后進行1∶2傳代，細胞長成單層時用于實驗。

將地龍的粗提取物分別用2%1640細胞維持液以2倍比做成共12個稀釋度，按稀釋度的順序將粗提取物橫向接種于2塊96孔板中的單層Hep-2細胞上，每個孔100μL，然后每個孔加入100μL的用2%1640細胞維持液(1∶10)稀釋的呼吸道合胞病毒，同時設細胞對照組、病毒對照組及陽性對照組。在37℃、5%CO2條件下培養，并且觀察細胞病變效應(CPE)。當病毒對照組CPE達90%以上時，用電子顯微鏡觀察，將96孔板中的培養液倒出，每孔加100μL的中性紅染液，放入37℃培養箱反應1h后取出，倒出染液，用緩慢的水流沖洗3～5次，甩干，每個孔加入100μL脫色液，放在37℃恒溫箱放置15min，再用酶標儀于540nm處測定吸光度(OD)值[6]。用Reed-Mucnch法分別計算它們的治療指數TI。

根據預實驗的結果，將地龍的水粗提取物加乙醇沉淀，得上清液和沉淀，編號為A、B，將醇粗提取物加水沉淀，得上清液和沉淀，編號為C、D。分別將A、B、C、D重復上述操作過程做體外抗病毒實驗。根據第二次的實驗結果將地龍醇提水沉后的沉淀D過大孔樹脂DM130，將洗脫液做上述體外抗病毒實驗。

3 結果

細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(細胞對照組OD值-空白組OD值)×100%[7]，如果存活率>50%，則視為有效。按照Reed-Muench氏法分析以上數據，計算藥物半數中毒濃度(TC50)和藥物半數有效濃度(EC50)。粗提取物的OD值測定結果見表1。醇提水沉和水提醇沉后的OD值測定結果見表2。過大孔樹脂的每個洗脫液的OD值測定結果見表3。

存活率=(病變孔OD值-空白孔OD值)/(細胞對照孔OD值-空白孔OD值)

病變率=1-存活率

細胞比距=(高于50%的病變率-50%)/(高于50%的病變率-低于50%病變率)

細胞存活率大于50%最后一個濃度為藥物半數有效濃度(EC50)

細胞存活率大于50%之前的濃度為藥物半數中毒濃度(TC50)

EC50=[Antilog(log高于50%存活率藥物稀釋度的值-比距)]

TC50=[Antilog(log高于50%病變率藥物稀釋度的值-比距)]

TI=EC50/TC50[8]

表1 地龍粗提取物各濃度的吸光度

表2 地龍水提醇沉和醇提水沉后各濃度的吸光度

表3 過大孔樹脂洗脫液各濃度的吸光度

按照Reed和Muench氏法計算表格數據，可以看出水粗提取物的抗病毒效果最好，TI為74.21；醇粗提取物經過加水后的沉淀抗病毒效果最好，TI為125.72；醇提水沉的沉淀過大孔樹脂DM130發現2號75%乙醇水溶液沖洗的洗脫液抑制呼吸道合胞病毒的效果最好，TI為63.05。利巴韋林的抑毒指數TI為117.62。

4 討論

RSV屬于副黏病毒科肺炎病毒屬，具有使細胞融合的活性[9]。它可以導致嬰幼兒急性下呼吸道感染，還可以引起間質性肺炎以及毛細支氣管炎等[10]，同時也可引起老年人和免疫缺陷病人肺炎死亡[11]。雖然呼吸道合胞病毒在50年前就備受關注，但是目前仍缺乏對其有效的預防治療措施。利巴韋林是廣譜的對呼吸道合胞病毒有一定療效的抗病毒藥物，但是經過研究發現，經過呼吸道合胞病毒感染的棉鼠模型出現了利巴韋林的抵抗株[12]，因此探索對呼吸道合胞病毒具有抑制作用的中藥天然藥物具有重大前景。

《神農本草經》記載了地龍具有消炎止痛、平喘、通絡等功效，通過用不同極性的溶劑提取，以及醇提水沉、水提醇沉和大孔樹脂柱吸附純化后發現，75%乙醇2號水溶液沖洗的洗脫液具有明顯的抗病毒作用，說明其為地龍抗病毒的主要活性部位，為分離出抗病毒的單體做好了前期準備。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部 [S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：122-123.

[2] 陳洪，陸亞琴，劉順英，等.地龍2號對大鼠肝纖維化TGF-131，MMP-13及TIMP-1mRNA和蛋自表達的影響[J].世界華人消華雜志，2004，12(10)：354-356.

[3] 孫月霞，吳淑娥.初膏濃度對醇沉效果的影響[J].基層中藥雜志，2000，14(5)：36.

[4] 陳勇，李頁瑞，金胤池，等.中藥醇沉工藝及裝備研究進展與思考[J].世界科學技術—中醫藥現代化，2007，9(5)：16-19.

[5] 吳琳華，樊宏偉.喉咽清制劑的體外抑病毒作用的實驗研究[J].中國中醫藥科技，2002，9(5)：320.

[6] 張麗，周長征.木芙蓉葉提取物抗病毒作用實驗研究[J].長春中醫藥大學學報，2013，29(1)：28-30.

[7] 張建軍，李洪源，王吉錫，等.甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用[J].中國公共衛生，2007，23(6)：723-724.

[8] 張少華，孟紅.翼果苔草提取物體外抗病毒的實驗研究[J].山東中醫雜志，2010，29(4)：48-49.

[9]GreenoughA，BroughtonS.ChronicmanifestationsofrespiratorysyncytialvirusInfectioninprematureinfants[J].PediatrinfectDisJ，2005，24(11Suppl)：184-187.

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[12]ZhaoXD，ChenFP，SullenderWM.Respiratorysyncytialvirusescapemutantderivedinvitroresist palivizumab prophylaxis in cotton rats[J].Virology，2004，318(2)：608.

ScreeningforAnti-RespiratorySyncytialVirusActivePartsofGeosaurus

ZHANGJiaze1，RENYing1，WANGQing1，HOUBaoshan1，NIUWenfei1，JIANGAiwen2，ZHOUChangzheng1*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.Thefirsthospitalaffiliatedtohebeiinstituteofnorth，Zhangjiakou075000，China)

Objective：To study anti-RSV activities of the crude extracts with different polarity after purified and separated from the Geosaurus，determine the effective parts of antivirus further.Methods：Ethyl acetate，95% ethanol and pure water were used as the solvent to extract drugs respectively.Anti-RSV activities in vitro were detected preliminarily by RSV-Hep-2virus-cell infection model of ethanol.Crude extracts were purified and separated further by water extraction ethanol precipitation and ethanol extraction water precipitation methods respectively.Supernatants and sediments were used as the antivirus experimentsinvitro.After the sediments from ethanol extraction water precipitation DM were filtered by130macroporous absorbent resin，the filters were eluted by25%、50%、75% ethanol respectively according to the results.In the end the antivirus experiments were carried out by the concentrated eluent.The cytopathic effect (CPE) was observed under a microscope.Neutral red staining was measured in a microplate reader at540nm to calculate the therapeutic index (TI).Results：Among the three total extracts from Geosaurus by ethyl acetate，95% ethanol and pure water，the pure water total extract was the most effective for Anti RSV(TI=125.72).The filters from sediments from ethanol extraction water precipitation DM were filtered by130macroporous absorbent resin，and it showed that eluent of75% ethanol in number2was the most effective for Anti RSV(TI=63.05).Conclusion：The ingredients of alcohol dissolved have the most significant inhibited effect on respiratory syncytial virus.

Geosaurus；crude extracts；water extraction ethanol precipitation methods；ethanol extraction water precipitation methods；macroporous resin；anti-respiratory syncytial virus (RSV)

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.009

2015-12-30)

山東省中醫藥抗病毒應用基礎與關鍵技術及產業化課題(XTCX2014C01-04)

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周長征，教授，碩士研究生導師，研究方向：藥物新劑型與新技術；E-mail：zcznfj@sina.com