云南粗莖秦艽斑枯病病原鑒定△

馬維思，楊麗英，王馨，董志淵，李林玉，李紹平，嚴世武，楊斌

(云南省農業科學院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205)

云南粗莖秦艽斑枯病病原鑒定△

馬維思，楊麗英，王馨，董志淵，李林玉，李紹平，嚴世武，楊斌*

(云南省農業科學院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205)

目的：明確云南種植的粗莖秦艽斑枯病的發生規律及病原菌的分類地位，以期為該病的防治提供依據。方法：通過田間調查掌握該病發生的基本規律，經組織分離、柯赫氏法則驗證獲得病原菌，依據真菌的形態特征和ITS序列特征確定其分類地位。結果：基于真菌形態和ITS序列特征，粗莖秦艽斑枯病病原被鑒定為小孢殼針孢Septoriamicrospora，該病在云南粗莖秦艽主要種植區普遍發生。結論：小孢殼針孢Septoriamicrospora是粗莖秦艽斑枯病病原菌。

粗莖秦艽；斑枯?。徊≡b定；小孢殼針孢

1 材料與方法

1.1 材料

粗莖秦艽斑枯病病株與接種用健康植株均采自麗江市玉龍縣魯甸鄉拉美榮村粗莖秦艽基地，經云南省農科院藥用植物研究所李紹平研究員鑒定為粗莖秦艽Gentianacrassicaulis。

PDA培養基：200 g馬鈴薯去皮切塊浸煮，濾除殘渣，20 g葡萄糖，17 g瓊脂，加水定容至1 L，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。不加瓊脂的PDA培養基為PD培養液。

Omega D3390-02真菌DNA小量提取試劑盒(廣州飛揚生物工程有限公司)；2X PCR Master(Taq，染料)即用PCR擴增試劑盒[生工生物工程上海(股份)有限公司，簡稱生工生物]；真菌ITS通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)與ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′)由生工生物合成。

1.2 方法

1.2.1 病害調查 2013—2014年，在粗莖秦艽不同生長期，通過田間觀察與走訪，對云南麗江市玉龍縣、迪慶州維西縣等粗莖秦艽主產區的斑枯病發生情況進行調查，了解該病的發生規律。

1.2.2 病原菌的分離與形態鑒定 從病葉上采集病原物，在顯微鏡(鳳凰PH100-3B41L-IPL)下，用顯微鏡攝像頭(MC-D500U(C))拍照記錄其特征，用Phmias2008 Cs ver3.0圖像處理軟件，分別測量50個分生孢子器和孢子的大小。采用組織分離法，從葉片病斑的病健結合處，剪取5 mm2左右的小塊，用有效氯含量4.8%～6%的84消毒液分別浸泡40、60、80、100 s進行表面消毒，無菌水沖洗3次，將4片相同消毒時間的組織小塊置于同一PDA平板上培養，將長出的真菌轉接到新的PDA平板上，與病葉上病原物特征一致的真菌初步視為粗莖秦艽斑枯病病原菌，用于致病性測定。

1.2.3 致病性測定 取3盆3年生健康粗莖秦艽，每盆2株，從PDA平板上取真菌孢子配成濃度1×106個孢子·mL-1的孢子液，用毛筆將孢子液刷到葉片上進行接種，另取3盆植株刷清水作對照。將對照和接菌植株置于人工氣候箱(上海一恒MGA-400H型)中，25 ℃、95%相對濕度，12 h光照、12 h黑暗培養，持續觀察30 d。對發生斑枯病的病葉進行病菌再分離，與接種菌進行形態比較，依據柯赫氏法則確定病原菌。

天空中飄下了一抹水色，氣騰騰的，像霧，像雨，又像風。不一會兒，一片天都變得灰蒙蒙的，無論是城市還是背影，在茫茫的煙水里連魁梧的輪廓都混沌了，更別提辨出誰是誰的寄托。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 從PDA平板上挑取菌塊，接種到含PD培養液的三角瓶中，25 ℃、140 r·min-1搖床培養120 h。培養好的菌液，10 000 r·min-1離心10 min，取沉淀。根據Omega D3390-02真菌DNA小量提取試劑盒說明書進行DNA提取，以真菌ITS4、ITS5為引物，用PCR擴增試劑盒擴增病原菌的ITS序列。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃補平5 min，4 ℃終止反應。PCR產物送生工生物進行雙向測序。

測序結果在NCBI數據庫進行BLAST比對，從比對結果中，選擇已公開發表的、ITS序列相似度最高的10株菌，與粗莖秦艽斑枯病病原菌進行比較，經過CLASTALX 1.83進行序列比對，利用MEGA6軟件，采用NJ(鄰接法)構建系統發育樹以確定病原菌的分類地位，系統樹各分支的置信度用bootstra Ptest(自舉檢驗法)檢驗，共進行1000次循環，根據Kimura-2參數計算各株遺傳距離值。

2 結果與討論

2.1 病害調查結果

粗莖秦艽一般播種育苗1年后移栽，移栽2～3年后采挖，經調查，在云南麗江市玉龍縣、迪慶州維西縣等主產區，1年生粗莖秦艽很少發生斑枯病，2～4年生植株均發病普遍，嚴重地塊植株發病率高達100%。病原菌在植株殘體上越冬，來年4月份新葉展開后即可見零星侵染，雨季到來后病情逐漸加重，其中8至9月發病最嚴重，斑枯病在田間常與銹病同時發生，一般不造成植株死亡，但導致葉片大面積枯萎，影響植株生長。

病害一般從近地面老葉的葉尖、葉緣開始發生，初生黃色、褐色小點，后擴大成近圓形不規則的病斑，病斑中央黃色至黃褐色，邊緣紅褐色，呈不明顯的輪紋，外緣有靛青色的暈圈，隨著病情加重，病斑擴大連成片，造成葉片大面積枯黃死亡，后期病斑中央產生深褐色的分生孢子器，多呈環狀或片狀聚集在葉片正面，背面較少(見圖1A、B、C)。病斑上產生分生孢子器釋放出的分生孢子成為粗莖秦艽生長期的傳染源。

注：A.田間發病癥狀；B.病斑；C.分生孢子器；D.病葉上分生孢子。圖1 粗莖秦艽斑枯病

2.2 病原菌的分離與形態鑒定

通過組織分離法獲得一種與葉片真菌孢子形態特征相似的真菌，編號CJQJ，依據柯赫氏法則，取CJQJ的孢子接種健康粗莖秦艽葉片，出現典型的斑枯病癥狀，而對照植株健康未見發病(圖2A)。從病斑上進行病原物的二次分離，獲得與接種真菌形態特征一致的真菌，據此確定CJQJ為粗莖秦艽斑枯病病原菌。

病原菌CJQJ在葉片病斑上的分生孢子器呈扁球形，具1圓形孔口，分生孢子器初時透明，埋生于葉表皮下，逐漸成熟后顏色加深變成暗褐色并突破葉表皮，露出葉表皮的分生孢子器直徑75.9～230.8 μm、平均(127.9±29.3) μm(見圖1C)。分生孢子針形，直或彎，兩端尖，基部較圓，有1～5(多為3)個隔膜，長16.2～29.4 μm、平均(22.1±2.8) μm，寬1.6～3.1 μm、平均(2.1±0.3) μm，孢子內具油球(見圖1D)。

病原菌在PDA培養基上生長緩慢，25 ℃培養20 d后的菌落直徑1.6 cm，菌落隆起，正面紫灰色，背面紫色，菌絲生長致密、具隔。將帶菌絲的菌塊轉移到新的PDA培養基上，2周后能在接種菌塊上產生大量分散的分生孢子器(見圖2B菌落中央的深色部分)，擴散到新培養基上的菌落部分，只長菌絲而不產生分生孢子器(見圖2B中灰白色的部分)。分生孢子器的形成首先是病原菌菌絲結集形成黑色乳突狀結構，再從其頂端產生近無色透明的分生孢子器，隨著體積的增加，分生孢子器顏色由無色透明逐漸變為肉紅色，無明顯的孔口，成熟的孢子器最后液化釋放分生出孢子(見圖2C)。PDA培養基培養長出的分生孢子較病葉產生的分生孢子短且分隔較少，披針形或鐮刀形，長10.3～21.2 μm、平均(14.1±2.3)μm，寬1.6～3.5 μm、(2.6±0.4) μm，1～4個隔，多為1個隔(見圖2D)。

依據寄主和真菌的形態特征，參考《中國真菌志》[4]，初步將粗莖秦艽斑枯病病原真菌鑒定為球殼孢目(Sphaeropsidales)殼針孢屬(Septoria)真菌小孢殼針孢S.microspora。

注：A.致病性測定；B.菌落特征；C.分生孢子器；D.分生孢子。圖2 致病性測定與PDA培養基上的病原菌特征

2.3 基于ITS序列的病原真菌鑒定

經雙向測序獲得粗莖秦艽斑枯病病原菌CJQJ 533bp的ITS序列，提交NCBI數據庫進行BLAST比對，同源性最高的10株菌均為殼針孢屬Septoria，其中序列登錄號KC874679的菌株Septoriamicrospora與CJQJ菌株同源性最高，相似性達到99%，文獻記載KC874679為甘肅產秦艽GentianamacrophyllaPall.斑枯病的病原菌[5]。

以1株序列編號GU237772的殼二孢屬(Didymella)真菌為外群，從BLAST檢索結果中，選已公開發表、且與CJQJITS序列相似度最高的10株菌，用MEGA6軟件的NJ法構建系統發育樹，結果見圖3。粗莖秦艽斑枯病病原菌CJQJ與小孢殼針孢(S.microspora)KC874679關系最為密切，只有2堿基差異，處在同一分支，據此確定CJQJ的分類地位為小孢殼針孢S.microspora，與形態鑒定結果一致。

圖3 基于真菌ITS序列構建的系統發育樹

3 討論

殼針孢(Septoria)引起的斑枯病是栽培龍膽科植物中較為常見的病害，鄢洪海等報道了龍膽草斑枯病由S.microsporaSpeg.和S.gentianaeThum.，S.gentinicolaBaudys et Picb 3種真菌引起，其中S.microspora是主要病原菌，危害性最強[6]。王艷、李金花等分別報道了甘肅栽培秦艽G.macrophylla、G.spp斑枯病的病原菌分別為S.microsporeSpeg.[5]和S.gentianaeThum.[7]。球殼孢目(Sphaeropsidales)真菌的分生孢子大小和顏色等特征在不同寄主植物可能出現比較大的差異，目前全世界報道的殼針孢屬(Septoria)有2000種以上，其中有些是同物異名[2]。在本研究中，云南粗莖秦艽斑枯病S.microspora在病葉上的分生孢子，形態特征與PDA培養基上長出的孢子有較大差異，病葉上的孢子較長、針形，分隔數多為3，與王艷報道的甘肅產秦艽G.macrophylla斑枯病病菌S.microspora相似[5]，ITS序列同源性達99%，只有2bp的差異，而PDA培養基長出的孢子較短、披針形，多為1個隔，與李金花等報道的甘肅栽培秦艽G.spp斑枯病病原菌S.gentianae接近[7]，二者是否為同物異名需要進一步研究確定。

粗莖秦艽以滇西北地區種植面積最大，基本為農戶自發分散種植，病害防治做不到統防統治，無法從源頭上徹底消除病原，導致斑枯病普遍持續發生。實踐證明，適時施用合適的殺菌劑對該病具有很好的防治效果。病害發生前噴施代森錳鋅、福美雙等保護性殺菌劑進行預防，病害發生后，噴施1～2次多菌靈、三唑酮等內吸性殺菌劑，對粗莖秦艽斑枯病及伴生的銹病均有很好的控制作用。秋末粗莖秦艽地上部分枯萎后，及時清理并集中燒毀干枯殘體，可有效減少越冬病原，對控制來年病害的發生也有積極作用。

致謝：論文撰寫過程中得到中國醫學科學院藥用植物研究所陳君老師的親切指導，本研究所需實驗儀器得到云南省農業科學院藥用植物研究所季鵬章博士的直接幫助，在此致以謝意！

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：270-271.

[2] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第62卷[M].北京：科學出版社，1988：68.

[3] 聶燕瓊，李海彥，孫娜，等.粗莖秦艽資源研究進展[J].中國現代中藥，2012，14(5)：37-40.

[4] 鄢洪海，夏淑春，于莉，等.龍膽草斑枯病的發生與病原菌鑒定[J].植物保護學報，1999，26(4)：315-318.

[5] 白金鎧.中國真菌志：第17卷·球殼目·殼二孢屬殼針孢屬[M].北京：科學出版社，2003：211-212.

[6] 王艷.甘肅省藥用植物球殼孢目真菌病害及其病原研究[D].蘭州：甘肅農業大學，2013.

[7] 李金花，柴兆祥，王蒂.秦艽斑枯病病原菌鑒定及生物學特性研究[J].中藥材，2007，30(1)：3-6.

PathogenIdentificationofGentianacrassicaulisLeafSpotinYunnanProvince

MA Weisi，YANGLiying，WANGXin，DONGZhiyuan，LILinyu，LIShaoping，YANShiwu，YANGBin*

(InstituteofMedicinalPlants，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming650205，China)

Objective：To identify the pathogen ofGentianacrassicaulisleaf spot in Yunnan province.Methods：The pathogen was isolated from leaf spot ofG.crasicauliswith Potato Dextrose Agar medium，tested and verified with Koch’s postulates，and identified Based on morphological and ITS DNA sequence.Results：The pathogen was identified asS.microspora.Conclusion：S.microsporais the pathogen ofG.crasicaulisleaf spot.

Gentianacrasicaulis；leaf spot；pathogen identification；Septoriamicrospora

2016-03-01)

云南省科技創新強省計劃項目(2014AE015)；云南省科技創新人才計劃(2015HB102)

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楊斌，副研究員，研究方向：藥用植物規范化栽培；Tel：(0871)65033575，E-mail：yb0872@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.008